馬發(fā)順，岳超，元雪湞，張大斌，梁秀麗

（1.安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽(yáng) 455000；2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000；3.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450000）

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是從黃芪的根系及莖稈中分離提取的具有生物活性的水溶性雜多糖[1]。APS可有效促進(jìn)雛雞免疫器官發(fā)育，提高血液中免疫球蛋白含量和T淋巴細(xì)胞數(shù)量[2]。APS不僅可增強(qiáng)斷奶羔羊免疫球蛋白水平，還可提高其抗病能力[3]。APS是一種免疫增強(qiáng)劑，在豬的免疫功能中起著重要作用，還可提高仔豬的日增重和料重比[4-5]。APS可以促進(jìn)禽類法氏囊和脾臟更好地發(fā)育，提高免疫功能指數(shù)[6]。APS不僅能促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)發(fā)育，還能抑制腸道病原菌生長(zhǎng)，促進(jìn)益生菌增殖[7]。目前關(guān)于APS生物活性檢測(cè)方面的報(bào)道較少，僅元雪湞等對(duì)APS生物活性檢測(cè)方法進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)并建立了檢測(cè)模型，對(duì)APS生物活性檢測(cè)中各因子之間的關(guān)系也只作了典型相關(guān)分析[8-10]，還沒(méi)有關(guān)于這些因子之間回歸分析的報(bào)道。本試驗(yàn)采用《中華人民共和國(guó)獸藥典2015版（二部）》提供的APS生物活性檢測(cè)方法，對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中的各個(gè)因子進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析和典型相關(guān)分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行回歸分析，以了解各因子之間的內(nèi)在聯(lián)系，定量描述部分因子之間的關(guān)系，為進(jìn)一步改進(jìn)APS生物活性檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明鼠（SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK2016-0002）40只，雌雄各20只，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。使用IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具飼養(yǎng)，設(shè)定溫度20～26℃，濕度60%，供給足量飼料，自由采食和飲水；飼料和飲水均經(jīng)高溫滅菌，紫外線照射消毒。

1.1.2 儀器和試劑

電子天平（型號(hào)ES3200），天津市德安特傳感技術(shù)有限公司生產(chǎn)；梅特勒分析天平（型號(hào)XS205DU），上海雙旭電子有限公司生產(chǎn)；獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具（型號(hào)IVC-Ⅱ），蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司生產(chǎn)；一次性使用無(wú)菌注射器（規(guī)格1 mL），圣光醫(yī)用制品有限公司生產(chǎn)。APS注射液[以葡萄糖（C6H12O6）計(jì)10mL：0.1g]，由河南省某獸藥廠提供；0.9%氯化鈉注射液（規(guī)格250 mL，國(guó)藥準(zhǔn)字H3702070766），購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將昆明鼠按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng)2d后，稱取小鼠始重。取體重18～20 g的健康小鼠40只，按性別分為2組，每組20只；再把雌、雄小鼠分別隨機(jī)分為2組，每組10只；隨機(jī)設(shè)為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射APS注射液0.5 mL/d，對(duì)照組每只小鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL/d，連續(xù)注射7 d；于最后一次注射24 h后將小鼠頸椎脫臼處死；稱取每只小鼠的體重、脾臟重、胸腺重，并計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)等。

1.2.2 因子的測(cè)定

把APS生物活性檢測(cè)中的因子分為兩類。第一類3個(gè)初始因子：處理方式（x1）：注射APS注射液賦值為“1”，注射生理鹽水賦值為“0”；性別（x2）：雄性賦值為“1”，雌性賦值為“0”；始重（x3）：試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的體重（g）。第二類5個(gè)效應(yīng)因子：脾臟重（x4）：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)摘取脾臟稱重（mg）；胸腺重（x5）：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)摘取胸腺稱重（mg）；末重（x6）：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體重（g）；脾指數(shù)（x7）：計(jì)算方法x4/x6；胸腺指數(shù)（x8）：計(jì)算方法x5/x6。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)按性別和處理方式進(jìn)行整理，計(jì)算出各因子的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。在同性別的試驗(yàn)組與對(duì)照組之間進(jìn)行各因子的差異性t檢驗(yàn)，接著進(jìn)行8個(gè)因子間的簡(jiǎn)單相關(guān)分析，然后對(duì)兩類因子進(jìn)行典型相關(guān)分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多元逐步回歸分析，建立回歸方程。使用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；使用DPS v7.05軟件進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析、典型相關(guān)分析和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)因子表現(xiàn)

對(duì)試驗(yàn)原始結(jié)果按性別和處理分組匯總。各因子的描述統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 APS生物活性檢測(cè)中各因子的描述統(tǒng)計(jì)

從表1可以看出，試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，x3雌性組和雄性組均差異不顯著（P＞0.05）；x4雌性組差異顯著（P＜0.05），雄性組差異極顯著（P＜0.01）；x7雌性組和雄性組均差異極顯著（P＜0.01）；x5、x6、x8雌性組和雄性組均差異不顯著（P＞0.05）。從變異程度看，x4、x5、x8變異程度較大，x3、x6、x7變異程度相對(duì)較小。

2.2 各因子間的簡(jiǎn)單相關(guān)關(guān)系

8個(gè)因子間簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 8個(gè)因子之間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)

從表2可以看出，3個(gè)初始因子間的相關(guān)關(guān)系均不顯著（P＞0.05）；5個(gè)效應(yīng)因子間，x4與x6、x7間均具有極顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），x5與x8間具有極顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），其余相關(guān)系數(shù)不顯著（P＞0.05）；3個(gè)初始因子與5個(gè)效應(yīng)因子間，x4與x1、x2間，x6與x2間，x7與x1間均具有極顯著相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

2.3 典型相關(guān)分析

3個(gè)初始因子（x1、x2、x3）與5個(gè)效應(yīng)因子（x4、x5、x6、x7、x8）之間的典型相關(guān)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 典型相關(guān)系數(shù)及其顯著性

從表3可知，前2個(gè)典型相關(guān)系數(shù)達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），第3個(gè)不顯著（P＞0.05）。可見(jiàn)，初始因子和效應(yīng)因子間的相關(guān)性主要由前2對(duì)典型變量所解釋。各因子的變異被2對(duì)達(dá)到極顯著水平的典型變量所解釋的比例見(jiàn)表4。

表4 各因子的變異能被2對(duì)典型變量解釋的比例

從表4可以看出，第1對(duì)典型變量U1、V1對(duì)初始因子可解釋的比例分別為36.90%、30.82%，對(duì)效應(yīng)因子可解釋的比例分別為21.86%、27.06%，第2對(duì)典型變量U2、V2對(duì)初始因子可解釋的比例分別為33.20%、21.79%，對(duì)效應(yīng)因子可解釋的比例分別為21.58%、33.70%。

2對(duì)典型變量的線性結(jié)構(gòu)式為：U1=-0.2378x1+0.8971x2+0.1826x3，V1=-0.1551x4-0.1341x5+1.1445x6-0.0498x7+0.0956x8；U2=-0.9642x1-0.2034x2-0.0983x3，V2=-1.2943x4+0.2562x5+0.5701x6+0.0154x7-0.0895x8。從線性結(jié)構(gòu)式中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小來(lái)看，U1中x2系數(shù)最大，其次是x1；V1中x6系數(shù)最大，其次是x4；U2中x1系數(shù)最大，其次是x2；V2中x4系數(shù)最大，其次是x6。說(shuō)明初始因子與效應(yīng)因子之間的相關(guān)關(guān)系主要是由x1、x2和x4、x6之間的密切關(guān)系所造成。

2.4 因子間的回歸方程

因?yàn)槠⒅笖?shù)（x7）是判定APS樣品是否合格的重要指標(biāo)，所以選擇x7作為因變量。因x7與x1、x4間均有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與x2、x6間也有正相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）；x7的變異主要被第2對(duì)典型變量（U2、V2）所解釋，此對(duì)典型變量主要反映x1、x2與x4、x6間的關(guān)系，而x1與x4間，x2與x4、x6間，以及x4與x6間均具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），所以，可把x1、x2、x4、x6納入自變量范疇，按試驗(yàn)組和對(duì)照組分別建立回歸方程。

試驗(yàn)組因子間的回歸方程為x7=6.176-0.068 x2+0.037 x4-0.230 x6（R2為0.992 6），對(duì)照組因子間的回歸方程為x7=3.902-0.052 x2+0.034 x4-0.134 x6（R2為0.992 1）。兩個(gè)回歸方程中各自變量對(duì)因變量的偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)見(jiàn)表5。

表5 回歸方程中的偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)

從表5可知，兩個(gè)回歸方程中x4、x6的偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），并且x4與x7之間呈正相關(guān)關(guān)系，x6與x7之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。通徑分析表明x4對(duì)x7的決定作用最強(qiáng)。

3 討論

從APS生物活性檢測(cè)中各因子的表現(xiàn)來(lái)看，小鼠的始重符合試驗(yàn)基本要求，并且試驗(yàn)組與對(duì)照組隨機(jī)安排效果良好。脾臟重（x4）試驗(yàn)組顯著（雌性，P＜0.05）或極顯著（雄性，P＜0.01）高于對(duì)照組，脾指數(shù)（x7）試驗(yàn)組極顯著高于對(duì)照組（雌性和雄性，P＜0.01），說(shuō)明APS對(duì)小鼠脾臟重（x4）和脾指數(shù)（x7）均有顯著作用（P＜0.05），而對(duì)胸腺重（x5）及胸腺指數(shù)（x8）無(wú)顯著作用（P＞0.05），此表現(xiàn)與元雪湞等[10]的研究結(jié)果相似。脾臟重（x4）、胸腺重（x5）和胸腺指數(shù)（x8）均存在較大的個(gè)體差異，可能是不同個(gè)體對(duì)APS的感應(yīng)度有所不同?，F(xiàn)行APS生物活性檢測(cè)方法中僅規(guī)定試驗(yàn)組平均脾指數(shù)與對(duì)照組平均脾指數(shù)之差大于等于2判定樣品合格，否則判定為不合格；既沒(méi)有關(guān)于試驗(yàn)動(dòng)物性別因素的限制，又沒(méi)有考慮試驗(yàn)誤差的影響。若能使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)并運(yùn)用到試驗(yàn)結(jié)果的判斷中，將會(huì)提高試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性與判斷的可靠性。

從8個(gè)因子間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)來(lái)看，3個(gè)初始因子間的相關(guān)系數(shù)均不顯著（P＞0.05），說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)嚴(yán)格遵守了隨機(jī)原則，試驗(yàn)動(dòng)物的初始條件控制良好。x4與x6、x7間極顯著的相關(guān)關(guān)系，與元雪湞等[10]的研究結(jié)果一致，充分說(shuō)明以脾指數(shù)作為APS生物活性檢測(cè)指標(biāo)的合理性。x4與x1、x2間的極顯著相關(guān)關(guān)系說(shuō)明試驗(yàn)處理和性別對(duì)脾臟重均有極顯著影響，這不僅進(jìn)一步證實(shí)了APS對(duì)脾臟生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，而且還揭示出在試驗(yàn)中應(yīng)考慮小鼠性別因素的必要性[8，10]。x1與x7之間極顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）對(duì)現(xiàn)行APS生物活性檢測(cè)方法具有有效支持，解決了元雪湞等[10]在討論中提出的問(wèn)題。盡管x5與x8間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），但x4和x5間、x7和x8間相關(guān)系數(shù)均不顯著（P＞0.05），所以，x8在APS生物活性檢測(cè)時(shí)的作用不大。

從典型相關(guān)分析得知，初始因子與效應(yīng)因子間的相關(guān)關(guān)系主要是由于x1、x2與x4、x6間的密切聯(lián)系所造成，這不僅與簡(jiǎn)單相關(guān)分析結(jié)果相吻合，也與元雪湞等[10]研究結(jié)果一致。這一方面支持了現(xiàn)行APS生物活性檢測(cè)方法的基本可行性，另一方面也揭示出現(xiàn)行方法中僅規(guī)定以試驗(yàn)組和對(duì)照組脾指數(shù)的差作為判斷標(biāo)準(zhǔn)而忽視試驗(yàn)動(dòng)物性別因素影響的缺陷。

本研究建立回歸方程時(shí)充分考慮了性別因素，試驗(yàn)組和對(duì)照組的回歸方程R2均大于0.99，擬合效果很好；所建立的回歸方程比元雪湞等[9]建立的檢測(cè)模型在自變量篩選方面更精準(zhǔn)可靠，使用效果會(huì)更好。此回歸方程可用于APS生物活性檢測(cè)時(shí)指標(biāo)的估算和驗(yàn)證，也可作為試驗(yàn)結(jié)果判定時(shí)的參考。建議有關(guān)部門(mén)在今后修訂APS生物活性檢測(cè)方法時(shí)把小鼠性別作為控制因素做出相應(yīng)規(guī)定。

4 小結(jié)

APS生物活性檢測(cè)中，試驗(yàn)組與對(duì)照組間脾臟重（x4）差異顯著（雌性，P＜0.05）或極顯著（雄性，P＜0.01），脾指數(shù)（x7）差異極顯著（雌性和雄性，P＜0.01）；3個(gè)初始因子間簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)均不顯著（P＞0.05），5個(gè)效應(yīng)因子間有3個(gè)相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），初始因子與效應(yīng)因子間的相關(guān)系數(shù)有4個(gè)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），有1個(gè)達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；初始因子與效應(yīng)因子間的典型相關(guān)系數(shù)為0.913 9（P＜0.01）、0.810 2（P＜0.01），兩類因子間的相關(guān)性主要由x1、x2與x4、x6間的相關(guān)關(guān)系所造成；試驗(yàn)組回歸方程為x7=6.176-0.068 x2+0.037 x4-0.230 x6（R2為0.992 6），對(duì)照組回歸方程為x7=3.902-0.052 x2+0.034 x4-0.134 x6（R2為0.992 1）。說(shuō)明現(xiàn)行的APS生物活性檢測(cè)方法基本可行，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)把試驗(yàn)動(dòng)物的性別作為控制因素納入試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異，以提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。