鄔 華，方 香，李 靜，藍 嬌，吳昊旻，梁旭霞

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是一種代謝性疾病，為妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖代謝異常，其發(fā)病原因復雜[1-2]。近年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、人們生活水平及生活方式的改變，妊娠婦女中肥胖或超重婦女占比不斷上升，GDM的發(fā)病率也隨之增加。據(jù)統(tǒng)計，我國GDM發(fā)病率為17.5%[3]。GDM患者產(chǎn)后患2型糖尿病的風險增加，GDM患者在產(chǎn)后9個月、15個月和5.2年的2型糖尿病的罹患率分別為3.7%、4.9%、13.15%[4]。妊娠合并糖尿病對母胎均有較多危害，需引起重視[5]。妊娠合并糖尿病中超過90%為GDM，其與不良妊娠結局有著密切關系。有學者認為應將GDM納入“大產(chǎn)科綜合征”中，與早產(chǎn)、胎膜早破、巨大兒、子癇前期、自然流產(chǎn)、胎兒生長發(fā)育異常、死胎、新生兒低血糖、新生兒呼吸窘迫綜合征等密切相關，強調了胎盤在母胎間的相互作用[6-7]。同源盒轉錄因子3(distal-less homeobox 3,DLX3)是一種轉錄調控因子，可調控滋養(yǎng)細胞的增殖、分化以及細胞凋亡[8]。Syncytin-1是人內源性逆轉錄缺陷病毒(human endogenous retroviruses,HERVs)成員中HERV-W編碼的糖包膜蛋白。有研究顯示，Syncytin-1具有介導識別、與宿主細胞受體結合的功能，在維持正常胎盤發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為介導滋養(yǎng)細胞增殖、分化融合并維持正常的細胞凋亡[9]。Choi等[10-11]發(fā)現(xiàn)DLX3對骨骼、牙齒的發(fā)育有重要影響。張薇等[12]指出DLX家族基因參與調控胚胎形態(tài)發(fā)生，是骨骼發(fā)育過程中的重要轉錄因子。本研究旨在比較GDM患者與正常妊娠婦女胎盤鈣化組織DLX3和Syncytin-1的表達水平，探討其在GDM發(fā)病機制中的作用及其與胎盤鈣化的相關性，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年9月至2018年9月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科產(chǎn)檢并住院的GDM患者30例作為觀察組。納入標準：(1)符合GDM的相關診斷標準[5，13]；(2)單胎足月孕婦；(3)自然受孕；(4)因單純產(chǎn)科因素擇期剖宮產(chǎn)終止妊娠。排除標準：(1)合并其他妊娠合并癥；(2)合并感染；(3)胎兒發(fā)育異常。另選擇同期健康孕產(chǎn)婦30名作為對照組。納入標準：(1)無GDM及其他妊娠合并癥；(2)無妊娠并發(fā)癥；(3)因單純產(chǎn)科因素擇期剖宮產(chǎn)終止妊娠分娩的單胎、自然受孕、足月孕婦。排除標準：(1)合并感染；(2)胎兒發(fā)育異常。觀察組年齡大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組在孕前體重、民族、孕次等其他基線資料方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(編號：KY-KJT-2015-1號)，研究對象均簽署知情同意書。

表1 兩組基線資料比較

1.2GDM的診斷標準 (1)GDM為妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)：孕產(chǎn)婦孕期規(guī)范產(chǎn)檢時在孕24～28周行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)，即試驗前連續(xù)3 d正常飲食(每日進食碳水化合物不少于150 g)，檢查期間靜坐、禁煙。OGTT前禁食至少8 h，5 min內口服含75 g葡萄糖的液體300 ml，分別抽取孕婦服糖前及服糖后1 h、2 h的靜脈血，測定血糖水平。空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)<5.1 mmol/L、1 h血糖<10.0 mmol/L、2 h血糖<8.5 mmol/L，任何一項異常(≥正常值)即診斷為GDM[5]。(2)若首次OGTT結果正常，孕婦具有GDM高危因素。①孕婦因素：年齡≥35歲、妊娠前超重或肥胖、糖耐量異常史、多囊卵巢綜合征。②糖尿病家族史。③妊娠分娩史：不明原因的死胎、死產(chǎn)、流產(chǎn)史、巨大胎兒分娩史、胎兒畸形和羊水過多史、GDM史。④本次妊娠因素：妊娠期發(fā)現(xiàn)胎兒大于孕周、羊水過多；反復外陰陰道假絲酵母菌病者。妊娠30～32周重復OGTT，如有任何一項異常(≥正常值)即診斷為GDM[13]。

1.3標本的收集 于研究對象剖宮產(chǎn)術中胎盤娩出后15 min內取標本，于近臍帶根部胎盤母體面肉眼可見鈣化區(qū)取約1 cm3組織1塊，以生理鹽水沖洗干凈，即刻分裝于經(jīng)焦炭酸二乙酯(diethylpyro-carbonate，DEPC)水處理過的2 ml凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測方法 采用TRIzol法提取胎盤組織標本總RNA,應用DNase I(Cat:M0303S,NEB)去除DNA后使用逆轉錄試劑盒(Cat:K1622,Thermo)將RNA逆轉為cDNA。應用QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒(Cat：208054，QIAGEN)進行RT-qPCR檢測，所用儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀，反應體系為20 μl，按照試劑盒說明書進行配制操作。RT-qPCR擴增參數(shù)：(1)95 ℃預變性2 min;(2)95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,共40個循環(huán)。引物序列見表2,由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。以GAPDH基因為內參，以2-△△Ct法計算相對表達量。對于Ct值≥30的樣本結果，以Ct值=30進行計算和統(tǒng)計。

表2 引物序列

1.5臨床觀察指標 (1)孕期體重增加量：孕期檢查發(fā)現(xiàn)GDM后常規(guī)加強孕期體重管理，以分娩前孕婦體重減去孕前體重所得值為孕期體重增加量。(2)巨大胎兒[5]：測量新生兒出生時體重，體重>4 000 g者為巨大胎兒。

2 結果

2.1兩組孕期體重增加量及巨大兒發(fā)生率比較 觀察組孕期體重增加量為(11.15±4.03)kg，對照組為(13.23±2.98)kg，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.069,P=0.044)。觀察組出現(xiàn)巨大兒3例(10.00%)，對照組1例(3.33%)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.268，P=0.605)。

2.2兩組DLX3和Syncytin-1 mRNA表達水平比較 觀察組DLX3 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。兩組Syncytin-1 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組DLX3和Syncytin-1 mRNA表達水平比較[M(P25,P75),2-△△Ct]

2.3影響GDM發(fā)生的多因素logistic回歸分析結果 以年齡、孕期體重增加量和DLX3 mRNA作為自變量，以GDM的發(fā)生情況為因變量(是=1，否=0)進行多因素logistic回歸分析，結果顯示，較高的DLX3 mRNA表達水平是促進GDM發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響GDM發(fā)生的多因素logistic回歸分析結果

3 討論

3.1目前，GDM的發(fā)生機制尚未完全闡明，有研究認為其發(fā)生與胰島素抵抗、氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應等因素有關[14]。GDM可能導致或加劇胎盤功能異常，通過改變胎盤結構或功能，從而增加圍產(chǎn)兒不良結局的發(fā)生。DLX3是同源異型盒DLX基因家族中的一員，是一種轉錄調控因子，對胚胎生長發(fā)育的調控有一定作用，可調控胎盤滋養(yǎng)細胞的增殖、分化以及凋亡[8]。另外，有研究表明，DLX3過表達可誘導胎盤生長因子(placenta growth factor，PGF)的表達，DLX3與膠質細胞缺失因子1(glial cell missing 1，GCM-1)可協(xié)同調控人滋養(yǎng)細胞衍生細胞中PGF的表達，二者的協(xié)調作用可導致PGF拮抗[15-16]。李艾珍[17]的研究顯示，孕中期腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和8-異前列腺素F2a(8-isoprostaglandins F2a，8-iso-PG F2a)與GDM的發(fā)生具有關聯(lián)性，認為氧化應激和炎癥因子可能引起GDM患者胎盤血管內皮細胞凋亡增加，導致功能障礙。GDM是妊娠常見合并癥,此類孕婦孕早期可能存在糖耐量受損，加之妊娠激素影響使機體對胰島素的敏感性進一步降低，以致不能維持正常血糖水平。本研究結果顯示，與正常妊娠者相比，GDM患者的DLX3 mRNA表達水平顯著增高，多因素logistic回歸分析結果顯示其為GDM發(fā)生的獨立危險因素，提示DLX3與GDM的發(fā)病機制具有關聯(lián)，具有應用于預測GDM發(fā)生的潛在臨床價值。另外，DLX3參與調控胚胎形態(tài)，是骨骼發(fā)育過程中的重要轉錄因子。本研究取材樣本為胎盤鈣化部位，不排除DLX3對于GDM胎盤鈣化的發(fā)病有一定的影響，但DLX3是否通過影響GDM的發(fā)生、發(fā)展而促進胎盤鈣化發(fā)生，有待進一步研究。

3.2HERVs大約占人類基因組的8%。有18個逆轉錄病毒包膜基因中均包含一個開放閱讀框，其中6個表達于胎盤組織，分別為HERV-K、HERV-R(b)、HERV-T、ERV3(HERV-R)、HERV-W和HERV-FRD，前3個在胎盤組織呈低表達，后3個在胎盤組織中呈高表達[18]。Syncytin-1是由HERVs成員中HERV-W編碼而形成的糖包膜蛋白，位于染色體7q21，由表面亞單位(surface subunits，SU)和跨膜亞單位(transmembran subunits，TM)組成，前者具有介導識別、與宿主細胞受體結合的功能，后者具有促進細胞膜融合功能，主要表達于胎盤合體滋養(yǎng)細胞，在維持正常胎盤發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用，主要為介導滋養(yǎng)細胞增殖、分化融合并維持正常的細胞凋亡[9]。大多數(shù)GDM患者的胎盤具有典型的組織學表現(xiàn)，如絨毛不成熟、絨毛纖維蛋白樣壞死、毛細血管和血管增殖等[7]。Soygur等[19]通過研究GDM胎盤標本中Syncytin-1、Syncytin-2及其受體的表達，發(fā)現(xiàn)在GDM胎盤病理中Syncytin-2及其受體促進調節(jié)蛋白超家族2(major facilitator superfamily domaining 2，MFSD2)的表達發(fā)生了改變，與正常胎盤相比較，Syncytin-2及其受體MFSD2蛋白表達下降，提示Syncytin-2可能參與GDM的發(fā)病機制。Murphy等[20]研究顯示，Syncytin-1的過表達上調了促炎因子的表達，如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等。有研究認為，胎盤產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)及抗氧化防御功能的失衡可能導致GDM相關的氧化應激[21]。Yu等[22]指出Syncytin是膠質細胞缺失因子a(glial cell missing a,GCMa)的靶因子，GCMa可正調控Syncytin。趙先蘭等[23]研究認為DLX3可能是Syncytin的上游調控因子。推測Syncytin-1可能通過促炎反應、誘導細胞死亡、氧化應激參與GDM的發(fā)生和發(fā)展，具體機制尚待進一步研究。但本研究結果顯示，GDM患者與非GDM患者的胎盤組織中Syncytin-1表達水平無顯著差異，這不排除由于樣本量較小的影響因素，結論仍需擴大樣本量進一步驗證。

3.3GDM會增加巨大胎兒的發(fā)生風險，考慮原因為胎兒長期處于母體高血糖所致的高胰島素血癥環(huán)境，蛋白、脂肪合成增加而脂解作用被抑制，導致軀體過度發(fā)育[5]。史亞波等[24]研究認為GDM誘導的高糖環(huán)境可上調胎盤組織中PGF的表達水平，減少胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡，使胎盤過度發(fā)育，進而增加巨大胎兒的發(fā)生風險。本研究中觀察組出現(xiàn)巨大兒3例(10.00%)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.605)，這也可能與本研究例數(shù)較少有關，但也不排除本研究對象均為規(guī)范產(chǎn)檢者，觀察組在確診GDM后均予以飲食、運動指導等干預。多因素logistic回歸分析結果顯示孕期體重增加量與GDM發(fā)生無顯著關聯(lián)，這可能得益于孕期相關體重控制等干預措施的開展。

綜上所述，DLX3可能參與了GDM的發(fā)病機制，也不排除DLX3促進了GDM胎盤鈣化的發(fā)生，其具體的發(fā)病機制有待進一步研究。Syncytin-1在GDM患者胎盤鈣化組織中的表達水平與正常妊娠者差異不顯著，這不排除是由于樣本量較小造成的結果偏倚，有待后續(xù)進一步擴大樣本量加以驗證。