楊祎辰 王二歡 王繼強 黨艷妮 唐茜琳 常暉 靳鵬博 馬存德

摘要 [目的]優(yōu)化甘松揮發(fā)油的提取工藝。[方法]通過單因素試驗考察粒徑、料液比、浸泡時間和提取時間對甘松揮發(fā)油含量的影響，選定工藝參數和變化水平。采用Box-Benhnken響應面法，以甘松揮發(fā)油含量為評價指標，建立數學回歸模型。[結果]粒徑527 μm、料液比1∶10.2（g∶mL）、提取時間10.9 h為最佳提取工藝，揮發(fā)油含量為4.12%。[結論]在該條件下甘松揮發(fā)油提取穩(wěn)定、可靠。

關鍵詞 甘松;揮發(fā)油;響應面法;提取工藝;優(yōu)化

中圖分類號 R 284.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）08-0152-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.042

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Study on Optimization of Extraction Process of Volatile Oil from Nardostachyos Radix et Rhizoma Based on Response Surface Methodology

YANG Yi-chen 1，2， WANG Er-huan 2， WANG Ji-qiang 2 et al

（1. Shaanxi Institute of International Trade & Commerce， Xianyang，Shaanxi 712046;2. Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Xi’an，Shaanxi 710075）

Abstract [Objective]To optimize the extraction process of volatile oil of Nardostachyos Radix et Rhizoma.[Method]The single factor experiment was used to investigate the influence of particle size， solid-liquid ratio， soaking time and extraction time on the volatile oil content of Nardostachyos Radix et Rhizoma， and the process parameters and change levels were selected. The Box-Benhnken response surface method was used to establish a mathematical regression model with the volatile oil content of Nardostachyos Radix et Rhizoma as the evaluation index. [Result] 527 μm particle size， 1∶10.2（g∶mL） solid-liquid ratio， and 10.9 h extraction time were the best extraction processes. Under these conditions， the volatile oil content was 4.12%. [Conclusion]Under this condition， the extraction of volatile oil from Nardostachyos Radix et Rhizoma was stable and reliable.

Key words Nardostachyos Radix et Rhizoma;Volatile oil;Response surface methodology;Extraction process;Optimization

甘松為敗醬科植物甘松（Nardostachys jatamansi DC.）的干燥根及根莖，其味辛、甘，性溫，外用祛濕消腫，內服則有理氣止痛、開郁醒脾之功效 [1]，其既是藏藥，又為我國傳統(tǒng)中藥材。甘松藥用歷史悠久，首載于陳藏器的《本草拾遺》 [2]。李時珍 [3]稱其“產于川西松洲，其味甘”，故而得名甘松，又名甘松香、香松。松洲，即今松潘縣，為四川省阿壩藏族羌族自治州轄縣。揮發(fā)油是辛味中藥最主要的化學成分類型 [4]。甘松藥材中含有大量揮發(fā)性成分，其中以萜類化合物為主，既可藥用，亦作香料。甘松揮發(fā)油具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗心律失常和保護心肌細胞等作用 [5]。當前對甘松揮發(fā)油的大量研究主要集中在揮發(fā)油成分的GC-MS分析及抗心律失常機制等，而關于甘松揮發(fā)油提取工藝的報道較少。帕依曼·亥米提等 [6]采用L9（3 4）正交試驗設計對甘松揮發(fā)油提取工藝進行優(yōu)選，結果表明最佳提取工藝條件為粗粉、加8倍量水、提取6 h。邱國旺等 [7]采用單因素試驗對甘松揮發(fā)油提取的不同因素進行研究，得出最佳工藝為投料量70%、加8倍量水、提取10 h。劉英慧 [8]采用L9（3 4）正交試驗設計優(yōu)選甘松揮發(fā)油得出的最佳提取工藝條件為加水量為10倍量、提取時間10 h、不浸泡。基于上述研究結果，該研究以甘松藥材為原料，參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（四部）通則2024揮發(fā)油測定法（甲法）提取其揮發(fā)油組分，通過單因素試驗考察提取工藝參數，利用響應面設計法對甘松揮發(fā)油的最佳提取工藝進行優(yōu)化，以期為甘松藥材揮發(fā)油的提取提供數據支持，也為甘松資源的合理開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 ?試驗材料

供試甘松藥材為步長制藥甘肅藥源基地移栽品（種源來自四川紅原縣），經陜西步長制藥有限公司馬存德主任藥師鑒定為敗醬科植物甘松（Nardostachys jatamansi DC.）。

1.2 試劑與儀器

98-I-C數顯控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）;高速多功能粉碎機（上海市天祺盛世科技有限公司）;5、10、24、35、100目標準檢驗篩（紹興市上虞華豐五金儀器有限公司）;娃哈哈飲用純凈水。

1.3 方法

1.3.1 甘松揮發(fā)油提取。

參照《中國藥典》2020年版（四部）通則2024揮發(fā)油測定法（甲法）測定甘松揮發(fā)油含量，并計算供試品的揮發(fā)油含量：

揮發(fā)油含量=甘松揮發(fā)油體積（mL）甘松藥材粉末量（g）×100%

1.3.2 工藝參數的篩選及優(yōu)化。

以揮發(fā)油提取率為評價指標，采用單因素試驗，分別考察粒徑、料液比（g∶mL）、浸泡時間和提取時間4個因素（表1）對甘松揮發(fā)油提取工藝的影響。根據單因素試驗結果，選定考察因素及其變化水平，采用Design Expert 11軟件中的Box-Benhnken響應面設計方法，設計試驗方案。以甘松揮發(fā)油含量為評價指標，建立數學回歸模型，對現(xiàn)行的甘松揮發(fā)油提取工藝進行優(yōu)化。

1.3.3 驗證試驗。

驗證試驗為確定該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，考慮到試驗誤差和實際生產，在上述試驗的基礎上，按篩選的最佳提取工藝條件進行重復驗證試驗3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗篩選影響因素與水平

2.1.1 粒徑對甘松揮發(fā)油含量的影響。

分別稱定不同粒徑的甘松樣品26.25 g，控制揮發(fā)油提取條件為料液比1∶8（g∶mL）、浸泡時間0 h、提取時間6 h，考察粒徑對甘松揮發(fā)油含量的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，隨著粒徑的減小，甘松揮發(fā)油含量先急劇增加后緩慢下降，在粒徑為500 μm時，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.41%。

2.1.2 料液比對甘松揮發(fā)油含量的影響。

控制甘松揮發(fā)油提取條件為粒徑500 μm、浸泡時間0 h、提取時間6 h，同時固定加水量為210 mL，依次稱定相應的甘松樣品適量，考察料液比對甘松揮發(fā)油含量的影響，結果見圖2。從圖2可以看出，隨著料液比的降低，甘松揮發(fā)油含量大體呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，在料液比為1∶10時，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.23%。

2.1.3 浸泡時間對甘松揮發(fā)油含量的影響。

分別稱定過35目篩的甘松樣品21.00 g（粒徑500 μm），控制甘松揮發(fā)油提取條件為料液比1∶10、提取時間6 h，考察浸泡時間對甘松揮發(fā)油含量的影響，結果見圖3。從圖3可以看出，隨著浸泡時間的延長，甘松揮發(fā)油含量變化不大，在浸泡時間8 h時，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.44%，較浸泡時間0 h時提高1.60%。

2.1.4 提取時間對甘松揮發(fā)油含量的影響。

分別稱定過35目篩的甘松樣品21.00 g（粒徑500 μm），控制甘松揮發(fā)油提取條件為料液比1∶10、浸泡時間0 h，考察提取時間對甘松揮發(fā)油含量的影響，結果見圖4。從圖4可以看出，隨著提取時間的延長，甘松揮發(fā)油含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在提取時間為10 h時，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.41%。

2.2 響應面法優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝

基于甘松揮發(fā)油提取的單因素試驗結果，結合實際生產條件與成本，篩選出粒徑（X1）、液料比（X2）和提取時間（X3）3個因素，采用Box-Benhnken響應面設計3因素3水平試驗方案，共15組試驗點，以綜合考慮甘松揮發(fā)油提取過程中的工藝參數。試驗因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3。

采用Design Expert 11軟件對表3中的數據進行二次多元回歸擬合，得到揮發(fā)油含量（Y）與粒徑（X1）、料液比（X2）、提取時間（X3）之間的回歸方程Y=4.09+0.110 0X1+0.131 2X2+0.088 7X3-0.127 5X1X2+0.017 5X1X3+0.025 0X2X3-0.657 5X1 2-0.585 0X2 2-0.100 0X3 2。由方程可知，各因素對甘松揮發(fā)油含量的影響大小排序為X2>X1>X3，即料液比>粒徑>提取時間。對上述回歸模型進行方差分析，結果發(fā)現(xiàn)，該模型P=0.000 5<0.01，說明該響應面回歸模型極顯著，且模型失擬項P=0.235 1>0.05不顯著，說明方程對試驗擬合較好。模型中X1、X2、X3、X1X2、X1 2、X2 2項具有顯著性，表明各個自變量與因變量的線性關系較為明顯，對各因素繪制曲面圖和等高線圖，更能直觀地反映各因素對響應值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值結果，詳見圖4。

根據Box-Benhnken響應面優(yōu)化設計試驗結果和擬合的回歸方程，采用Design Expert 11軟件擬合后得到最優(yōu)揮發(fā)油提取工藝參數為粒徑527 μm、料液比為1∶10.2、提取時間10.9 h，在此條件下得到的揮發(fā)油含量為4.12%。

2.3 工藝驗證

為驗證響應面法所得結果的可靠性，確定該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，同時考慮到試驗的可操作性和便捷性，精密稱定甘松樣品26.25 g，重復3次。選擇揮發(fā)油提取工藝參數為粒徑500 μm、料液比1∶10、提取時間10 h。分別計算揮發(fā)油含量，平均值為3.95%（RSD=2.98%，n=3）。

3 結論與討論

近年來，關于甘松藥材揮發(fā)油含量的測定及成分分析等方向的文獻報道不多，但對于揮發(fā)油含量的表達方式不統(tǒng)一。例如揮發(fā)油得率、揮發(fā)油收率 [9]、揮發(fā)油體積分數 [10]、收油率及百分含量，其實際計算方式均與《中國藥典》2020年版（四部）通則2024揮發(fā)油測定法中的揮發(fā)油含量相同?！吨袊幍洹访鞔_指出，揮發(fā)油含量是揮發(fā)油量與供試藥材質量的比值（mL∶g），甘松的揮發(fā)油含量不得少于2.0%（mL∶g），而該研究中測試的甘松樣品所含揮發(fā)油高于藥典標準?？紤]到此次研究所用的甘松樣品為移栽品，故生長年限高于野生品。揮發(fā)油為植物的次生代謝產物，隨著生長年限的延長，次生代謝產物含量的積累亦會增加。張宇霞等 [10]通過對不同批次的栽培、野生及市售甘松藥材的揮發(fā)油含量進行對比測定，結果顯示各批次甘松揮發(fā)油的體積分數為2.0%～5.2%，并且栽培品的揮發(fā)油含量明顯高于野生及市售品。余海清等 [11]通過對四川甘孜州不同產地甘松藥材的揮發(fā)油進行含量測定分析，結果發(fā)現(xiàn)不同產地甘松揮發(fā)油含量存在差異，并且與產地氣候環(huán)境、藥材生長年限等因素有關。這均與該研究結果保持一致。

甘松是唯一被現(xiàn)行版《中國藥典》收錄的敗醬科植物，多分布于青藏高原地區(qū)如甘南、阿壩及果洛等州。甘松藥材的市場供給完全來源于野生資源，隨著野生甘松的不斷采挖，導致藥材價格逐年上漲。雖然《中國藥典》中規(guī)定甘松的入藥部位為根及根莖，但市面上流通的甘松藥材往往以全草形式流通。當地政府亦通過監(jiān)督手段，對甘松藥材的采挖及分布的草場進行保護，以期實現(xiàn)甘松野生資源的可持續(xù)利用。但通過在甘南、阿壩和果洛等州的實地調查，甘松野生資源的恢復情況及資源現(xiàn)狀仍不容樂觀。

當前，由于《中國藥典》中對甘松藥材的生長年限沒有規(guī)定，亦未實行有效的甘松藥材規(guī)格等級標準，從而導致牧民采挖甘松完全按照市場行情進行;另一方面，甘松作為芳香類藥材，常被作為揮發(fā)油的提取材料，而甘松藥材提取后的藥渣及廢棄物卻未能再進行有效的利用，這無疑是對資源的極大破壞和浪費。因此，該研究參照《中國藥典》提取甘松揮發(fā)油，通過單因素試驗考察提取工藝參數，利用響應面設計法對甘松揮發(fā)油的最佳提取工藝進行優(yōu)化，規(guī)范甘松揮發(fā)油提取的技術路線，以期為甘松藥材揮發(fā)油的提取提供數據支持，也為甘松資源的合理開發(fā)利用提供理論依據。

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