文靜 劉霜飛 丁逸 徐琴 王杉 周晴 羅宇航 魏瑩

（1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637100；2.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637100；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637100）

宮頸癌主要由感染人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）引起，是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，該病死亡率高，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是全球面臨的一項(xiàng)重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[1]。目前臨床常采用以手術(shù)和放療為主、化療為輔的綜合治療方案[2]。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)以及整體調(diào)控的特點(diǎn)，對(duì)HPV的治療具有一定的優(yōu)勢(shì)，臨床實(shí)踐表明，治療HPV中藥方劑的成方規(guī)律為抗癌解毒藥與補(bǔ)氣藥為主，補(bǔ)血藥與活血化瘀藥為輔[3]。

斑蝥復(fù)方制劑具有扶正祛邪、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[4]，在臨床主要與手術(shù)、化療聯(lián)合使用起到臨床輔助治療的效果，增強(qiáng)抗癌作用，減輕化療藥物的毒副反應(yīng)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[5]聯(lián)合分子對(duì)接技術(shù)研究斑蝥復(fù)方制劑的活性成分及潛在作用機(jī)制，以期為后續(xù)斑蝥復(fù)方制劑治療HPV的體內(nèi)外研究及新藥的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 斑蝥復(fù)方制劑活性成分和潛在作用靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），以斑蝥復(fù)方制劑主要組成藥物斑蝥、黃芪、人參為關(guān)鍵詞檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件，獲取藥物的主要活性成分。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲取相應(yīng)的基因名稱、基因ID。

1.2 疾病靶點(diǎn)的獲取及疾病-藥物靶點(diǎn)的Venn分析

以“Tumors or cancer of the UTERINE CERVIX”和“Uterine Cervical Neoplasms”為關(guān)鍵詞，挖掘genecards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://omim.org/）兩大數(shù)據(jù)庫(kù)中的潛在靶點(diǎn)。以Relevance score≥15篩選得到疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)同時(shí)導(dǎo)入BioVenn（http://www.biovenn.nl/index.php）獲取交集靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)格（PPI）的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)的分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)格模型，設(shè)置生物種屬為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分為“highest confidence(>0.900)”。使用Cytoscape3.8.2可視化，利用CytoNCA對(duì)網(wǎng)格進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 生物功能與通路分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析，在生物信息學(xué)平臺(tái)（http://www.bioinformation.com .cn/）上繪制GO和KEGG富集分析的氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)格的構(gòu)建

以3種中藥、34種活性成分和110個(gè)交集靶點(diǎn)與顯著富集的20條通路為原數(shù)據(jù)，應(yīng)用Cytoscape3.8.2構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)格并隱藏?zé)o相互作用的節(jié)點(diǎn)。

1.6 活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

利用AutoDock Tools 1.5.6進(jìn)行分子對(duì)接，以驗(yàn)證其相互作用活性。從TCMSP下載活性成分的mol2格式文件。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)Pymol軟件執(zhí)行去水、加氫等操作。運(yùn)用AutoDock程序進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算結(jié)合能，對(duì)接結(jié)果采用Discovery studio進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方斑蝥制劑活性成分與藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出斑蝥、黃芪、人參的活性成分，經(jīng)過(guò)OB≥30%和DL≥0.18的限定，再剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，最終得到34種活性成分。其中斑蝥1種，人參和黃芪各17種，合并去重，最終確定211個(gè)藥物靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 斑蝥復(fù)方制劑候選化合物信息表

2.2 疾病-藥物靶點(diǎn)的獲取

經(jīng)GeneCards、OMIM兩大數(shù)據(jù)庫(kù)篩選去重，共獲取1218個(gè)宮頸癌相關(guān)靶點(diǎn)。疾病-藥物靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析后，獲得110個(gè)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 斑蝥復(fù)方制劑藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集分析

2.3 PPI網(wǎng)格分析

度值越高的靶點(diǎn)越接近同心圓的中心，其體積越大。靶點(diǎn)重要性與度值成正相關(guān)，分析十個(gè)核心靶點(diǎn)，如表2。TP53度值最高，能與34個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。其次是AKT1，與32個(gè)靶蛋白相關(guān)聯(lián)。

表2 斑蝥復(fù)方制劑治療宮頸癌的主要靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)

2.4 GO和KEGG富集分析

以P≤0.001為參考標(biāo)準(zhǔn)，GO富集分析得到367條生物過(guò)程，18項(xiàng)分子功能相關(guān)，4項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)。圖2列舉了富集最顯著的10個(gè)條目。GO分析中生物過(guò)程主要涉及對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路等。細(xì)胞組成涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物、受體復(fù)合物等。分子功能主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。

圖2 斑蝥復(fù)方制劑抗宮頸癌交集靶點(diǎn)的GO功能富集分析

KEGG富集分析以P≤0.01為參考標(biāo)準(zhǔn)，共富集得到256條通路，圖3列舉了P值排名前20的富集通路。人類疾病相關(guān)通路、炎癥和免疫相關(guān)通路、內(nèi)分泌代謝通路均參與宮頸癌的病理發(fā)展。癌癥通路，IL-17信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路均與較多核心靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，推測(cè)其在宮頸癌的潛在治療機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

2.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-途徑”網(wǎng)絡(luò)分析

藥物-成分-靶點(diǎn)-途徑網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。據(jù)網(wǎng)格分析，主要靶點(diǎn)為PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、RELA、AKT1等。槲皮素作用于76個(gè)靶點(diǎn)，是復(fù)方斑蝥制劑治療宮頸癌最主要的活性成分。癌癥途徑和PI3K-Akt信號(hào)通路是最主要的兩個(gè)信號(hào)通路。暗示出斑蝥復(fù)方制劑治療宮頸癌的多組分、多靶點(diǎn)、多通路特點(diǎn)。

2.6 分子對(duì)接

“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)格圖中度值排名靠前的6種活性成分與PPI網(wǎng)格中度值較高的7個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)圖6。一般認(rèn)為，結(jié)合能越低，分子結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。對(duì)接結(jié)果顯示，β谷甾醇與HSP90AA1的結(jié)合能最低，為-6.13KJ?mol-1。其次是JUN和異鼠李堿，結(jié)合能為-5.86KJ?mol-1。β谷甾醇和芒柄花素與多個(gè)靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合能力，JUN和HSP90AA1是結(jié)合能力最顯著的靶點(diǎn)。分子對(duì)接構(gòu)象和相互作用見(jiàn)圖5。

圖6 結(jié)合自由能的熱圖

3 討論

斑蝥復(fù)方制劑多由斑蝥、人參、黃芪、剌五加等中藥組成，臨床已使用多年。斑蝥在古代已有使用，但其毒性甚大，應(yīng)用受到限制[6]。如今先進(jìn)的現(xiàn)代技術(shù)使得斑蝥復(fù)方制劑的抗腫瘤效果得到了廣泛的認(rèn)同[7-9]。

臨床研究表明，斑蝥素可減弱Hela宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲[10]，宮頸癌患者應(yīng)用復(fù)方斑蝥膠囊聯(lián)合化療，能顯著提高患者生命質(zhì)量[11]等。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探討斑蝥復(fù)方制劑各成分在機(jī)體分子層面的生物靶點(diǎn)，推測(cè)藥物的效應(yīng)機(jī)制，闡釋其抗宮頸癌的作用機(jī)制。

本研究選擇了斑蝥復(fù)方制劑中的斑蝥，人參，黃芪三味主要藥物進(jìn)行分析，推測(cè)槲皮素、山奈酚、β谷甾醇等為治療宮頸癌的核心成分。槲皮素（Quercetin）具有良好的抗腫瘤活性[12]，可不同程度地抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和濃度依賴性[13-14]。山奈酚（Kaempferol）能抑制ERK/MAPK通路和PI3K-AKT通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15-16]，這也與本研究結(jié)論相映襯。而β谷甾醇（beta-sitosterol）能通過(guò)介導(dǎo)AMPK、PTEN和HSP90發(fā)揮抗腫瘤作用[16]，其抗宮頸癌的栓劑已經(jīng)用于臨床[17]。

本研究得到了斑蝥復(fù)方制劑治療宮頸癌的核心靶點(diǎn)，包括TP53、HSP90AA1等。李志強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)TP53的表達(dá)特點(diǎn)在宮頸癌的術(shù)后復(fù)發(fā)中有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值[18]。同時(shí)TP53調(diào)控通路中P53基因單核苷酸多態(tài)性與HPV相關(guān)宮頸癌遺傳易感性相關(guān)[19-20]。本研究顯示，兩大網(wǎng)格中HSP90AA1均具有很高的度值，其與多個(gè)活性成分均有較低的結(jié)合能。研究表明，宮頸癌組織中檢測(cè)到高水平的Hsp90[21]，且抑制Hsp90可有效誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡[22]。

通過(guò)GO功能和KEGG通路富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)參與多種生物過(guò)程來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。KEGG通路主要富集于癌癥相關(guān)途徑、IL-17信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。Simone Punt指出Tregs和IL-17+細(xì)胞數(shù)量少與宮頸癌特異性生存率低相關(guān)[23]，Th17細(xì)胞和IL-17在高危HPV感染中，可起到增強(qiáng)免疫力的作用[24]。而PI3K/AKT/mTOR途徑被認(rèn)為是一個(gè)有前途的抗癌治療靶點(diǎn)，在病毒/宿主細(xì)胞串?dāng)_中起關(guān)鍵作用[25]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了斑蝥復(fù)方制劑治療宮頸癌的活性成分、靶點(diǎn)以及作用機(jī)制，為后續(xù)斑蝥復(fù)方制劑治療宮頸癌的分子機(jī)制及新藥的開(kāi)發(fā)提供新的思路。但由于數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)在不斷更新，部分?jǐn)?shù)據(jù)尚不全面，不能覆蓋所有中藥、靶點(diǎn)、通路。所以本研究結(jié)論尚有一定的局限性，其具體機(jī)制還需更深入的研究。