楊森，何晗，易達(dá)，王福，劉友平，陳林*，陳鴻平*

1(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都，611137)2(四川省南充市食品藥品檢驗(yàn)所，四川 南充，637002)

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)為蕓香科花椒屬(ZanthoxylumL.)植物的成熟果實(shí)，主產(chǎn)于四川盆地及其周邊山地和重慶江津一帶[1-2]。竹葉花椒因其清香麻鮮的味道和翠綠的色澤受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，近年來(lái)其近成熟的干燥果實(shí)常作為“青花椒”商品而備受關(guān)注[3]。

揮發(fā)油是竹葉花椒香味的主要表征成分，也是其品質(zhì)評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，主要由烯類、醇類、酮類、醛類等成分組成[4]。目前對(duì)花椒揮發(fā)油的研究主要集中在化學(xué)成分分析和藥理活性的研究上，如對(duì)不同檢測(cè)方式、不同提取方式、不同炮制方式、不同品種、不同產(chǎn)地的花椒揮發(fā)油中的揮發(fā)性成分的組成及相對(duì)含量的差異進(jìn)行比較[5-11]，結(jié)果表明不同花椒揮發(fā)油揮發(fā)性成分差異較大，但主要以烯類、醇類成分為主；對(duì)花椒揮發(fā)油的抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、促透皮吸收等藥理活性進(jìn)行研究[12-14]。但目前關(guān)于竹葉花椒揮發(fā)油中揮發(fā)性成分的定量分析研究報(bào)道較少，鄧凱文等[15]、司昕蕾等[16]僅對(duì)花椒揮發(fā)油中主要成分芳樟醇、檸檬烯的含量進(jìn)行了測(cè)定，現(xiàn)行的國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30391—2013、四川地方標(biāo)準(zhǔn)SCYCBZ 2019-001等也僅對(duì)花椒揮發(fā)油的含量做出了要求(≥4%)，對(duì)具體成分含量并未做出規(guī)定。

鑒于揮發(fā)油是竹葉花椒的重要質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，在前期系統(tǒng)調(diào)研的基礎(chǔ)上，本文選取了已報(bào)道竹葉花椒揮發(fā)油中含量較高的12種代表性成分(α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯)，利用氣相色譜-質(zhì)譜/選擇離子監(jiān)測(cè)法(gas chromatography-mass spectrometry/selected ion monitor，GC-MS/SIM)建立了竹葉花椒揮發(fā)油中多種揮發(fā)性成分定量檢測(cè)的方法，并測(cè)定了22個(gè)產(chǎn)地竹葉花椒揮發(fā)油中12種揮發(fā)性成分的含量，以期為竹葉花椒質(zhì)量評(píng)價(jià)及其標(biāo)準(zhǔn)提供參考[17-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水楊酸甲酯(AF20070751)、1-壬醇(AF20122111)、環(huán)己酮(AF20122116)、萜品油烯(AF20122117)、α-石竹烯(AF20122010)、β-石竹烯(AF20032353)、α-蒎烯(AF9091602)、月桂烯(AF20122051)、L-α-松油醇(AF20081520)、D-檸檬烯(AF20051051)、芳樟醇(AF20072551)、檜烯(AF201220)、β-蒎烯(AF20122009)、萜品醇(AF20122006)、乙酸芳樟酯(AF20122007)，均為色譜純，純度98%，成都克洛瑪生物科技有限公司提供；正己烷為色譜純，成都科隆化學(xué)試劑有限公司。

竹葉花椒樣品通過(guò)委托不同產(chǎn)地商家代為購(gòu)買，并在實(shí)驗(yàn)室除去多余的雜質(zhì)和種子，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)陳鴻平教授鑒定樣品來(lái)源均為蕓香科花椒屬植物竹葉花椒干燥成熟果皮，樣品信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器與設(shè)備

77890Aglient GC型氣相色譜儀、5975 MSD型質(zhì)譜儀、質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)NIST 14、HP-5MS 5%苯基甲基硅氧烷氣相色譜柱，美國(guó)Aglient公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)油提取[19]

取竹葉花椒粉末樣品，粉碎過(guò)2號(hào)篩，混勻，每組15 g，稱定，平行3次，加水200 mL，振搖混合均勻，浸泡2 h，按《中國(guó)藥典》2020版四部(2204)揮發(fā)油測(cè)定甲法蒸餾得到不同產(chǎn)地竹葉花椒揮發(fā)油。

1.3.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯，置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度，得對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為1.263、1.340、1.249、1.216、7.826、0.699、1.035、9.430、0.279、0.748、0.905、2.943 mg/mL。

內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密量取稱取1-壬醇，加入正己烷稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.288 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

供試品溶液的制備：取不同產(chǎn)地竹葉花椒揮發(fā)油20 μL定容至25 mL，取1 mL至5 mL容量瓶中，加入30 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，定容，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜即得。

1.3.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣；體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度230 ℃，分流比30∶1。升溫程序：60 ℃保持1 min，以1 ℃/min升溫至73 ℃，再以5 ℃/min升溫至165 ℃，最后以20 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源(electron impact ion source，EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲9 min；定性采用全掃描，掃描范圍40～500，駐留時(shí)間0.2 s。定量采用選擇離子掃描模式(SIM)，SIM參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 選擇離子檢測(cè)模式參數(shù)Table 2 Selected ion detection mode parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離結(jié)果

12種揮發(fā)性成分在此條件下分離效果如圖1所示。由圖1可知在該條件下12種揮發(fā)性成分的分離效果較好。

1-α-蒎烯；2-檜烯；3-β-蒎烯；4-月桂烯；5-D-檸檬烯； 6-γ-松油烯；7-萜品油烯；8-芳樟醇；9-α-松油醇；10-乙酸方樟酯； 11-α-石竹烯；12-β-石竹烯(下同)圖1 十二種揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 12 volatile components

2.2 內(nèi)標(biāo)物的篩選

選擇1種竹葉花椒揮發(fā)油中不含有且不產(chǎn)生，同時(shí)與竹葉花椒中揮發(fā)性成分性質(zhì)相似的揮發(fā)性物質(zhì)，沸點(diǎn)相近，揮發(fā)后性質(zhì)穩(wěn)定，保證其在色譜柱上能與其他揮發(fā)性成分分開(kāi)。本文比較了環(huán)己酮、1-壬醇、水楊酸甲酯3種物質(zhì)，由圖2可知其保留時(shí)間分別為8.014、22.971、23.903 min，環(huán)己酮出峰時(shí)間早于其他揮發(fā)性成分，而水楊酸甲酯的保留時(shí)間與α-松油醇的保留時(shí)間(23.759 min)相近，分離效果不佳，故選擇1-壬醇作為內(nèi)標(biāo)。

2.3 定量離子對(duì)的選擇

在上述色譜和質(zhì)譜條件下不同揮發(fā)性成分及內(nèi)標(biāo)物的離子選擇結(jié)果見(jiàn)表2。選擇其中豐度較高的離子作為定量和定型離子。

圖2 內(nèi)標(biāo)物考察結(jié)果Fig.2 Results of investigation of internal standards

2.4 線性范圍、檢出限、定量限

精密量取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，定容混勻，即得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品質(zhì)量溶液。以內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量與對(duì)照品響應(yīng)值之比作為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度之比作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，結(jié)果見(jiàn)表3。以目標(biāo)化合物色譜峰信噪比(S/N)大于3的質(zhì)量濃度確定檢出限，信噪比(S/N)大于10的質(zhì)量濃度確定為定量限。不同揮發(fā)性成分的檢出限和定量限如表3所示。

表3 線性關(guān)系及回收率考察結(jié)果Table 3 Results of linear relationship investigation

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度

取同一對(duì)照品溶液，按1.3.3檢測(cè)條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各揮發(fā)性成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物的比值，測(cè)得12種揮發(fā)性成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值分別為4.79%、5.25%、4.98%、5.28%、5.81%、5.43%、5.58%、1.43%、4.76%、5.89%、5.03%、4.76%，表明該儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性

取竹葉花椒揮發(fā)油(S20)，按1.3.2制備加標(biāo)試樣，分別于0、8、14、18、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)定并記錄各成分與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，測(cè)得12種揮發(fā)性成分的RSD值分別為1.66%、3.95%、3.79%、4.41%、4.43%、3.31%、2.68%、2.93%、3.92%、3.93%、5.62%、3.69%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性

取樣品S20揮發(fā)油溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備平行供試品溶液6份，按照“1.3.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，計(jì)算各揮發(fā)性成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物的比值，測(cè)得12種揮發(fā)性成分的RSD值分別為4.01%、3.21%、5.00%、3.12%、5.28%、3.44%、4.06%、4.74%、3.98%、2.89%、2.56%、2.91%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加標(biāo)回收率

取竹葉花椒揮發(fā)油(S20)，精密加入α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯對(duì)照品，按照1.3.3的條件進(jìn)行測(cè)量,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。RSD在0.007%～5.862%，回收率在98.333%～105.487%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)不同產(chǎn)地的22批竹葉花椒中的揮發(fā)油進(jìn)行了提取，并對(duì)其中12種揮發(fā)性成分進(jìn)行了定量分析，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。所測(cè)定的22個(gè)產(chǎn)地的樣品中，均含有以上12種揮發(fā)性成分，但含量差異較大，不同產(chǎn)地竹葉花椒中12種揮發(fā)性成分的含量范圍由高到低依次為：芳樟醇(293.938～413.975 mg/mL)、檜烯(33.858～123.442 mg/mL)、D-檸檬烯(28.832～57.988 mg/mL)、月桂烯(13.570～35.067 mg/mL)、乙酸芳樟酯(2.540～24.212 mg/mL)、α-石竹烯(9.115～15.085 mg/mL)、β-石竹烯(6.111～16.675 mg/mL)、α-松油醇(3.058～6.088 mg/mL)、γ-松油烯(1.794～3.515 mg/mL)、α-蒎烯(0.851～3.720 mg/mL)、萜品油烯(0.807～1.421 mg/mL)、β-蒎烯(0.178～0.608 mg/mL)。

2.7 聚類分析

以22批竹葉花椒中12種揮發(fā)性成分的含量為數(shù)據(jù)源，以平方歐式距離進(jìn)行層次聚類分析,聚類結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)歐式距離為15時(shí)，22批竹葉花椒被聚成三類，其中樣品S17、S19、S16、S11聚為一類，S3、S20聚為一類，其余樣品聚為一類。整體來(lái)看，竹葉花椒揮發(fā)性成分與地域關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，如南充市營(yíng)山縣和儀隴縣，巴中市平昌縣和通江縣均被聚為不同的類別，這可能是由于竹葉花椒中揮發(fā)性成分不穩(wěn)定，且不同的產(chǎn)地加工方式、氣候條件、栽培品種等多因素導(dǎo)致不同產(chǎn)地竹葉花椒揮發(fā)性成分差異較大，從而導(dǎo)致其不能很好地聚類[20-22]。

圖3 不同產(chǎn)地竹葉花椒揮發(fā)油聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis results of volatile oil of Zanthoxylum armatum DC.from different origin

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3) 單位:mg/mL

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)利用GC-MS/SIM技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定竹葉花椒中12種主要揮發(fā)性成分含量的方法，在選擇離子檢測(cè)方式下，僅對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定性和定量，減少了雜質(zhì)峰的干擾，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，該方法所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性好、選擇性高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可作為竹葉花椒精油質(zhì)量控制的檢測(cè)方法[23-24]。

對(duì)四川境內(nèi)22個(gè)產(chǎn)地的竹葉花椒揮發(fā)油中12種揮發(fā)性成分分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地竹葉花椒揮發(fā)油中揮發(fā)性成分均以芳樟醇、檸檬烯、檜烯為主，但含量差異較大，其揮發(fā)性成分無(wú)明顯的地域差異，這可能是由于加工方式、栽培品種、產(chǎn)地等多種因素造成的。揮發(fā)性成分的差異，常會(huì)引起藥理活性的改變，而本研究采用GC-MS/SIM對(duì)竹葉花椒中常報(bào)道的12種揮發(fā)性成分進(jìn)行了定量，也為后續(xù)揮發(fā)油的選擇及藥理作用的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為竹葉花椒的質(zhì)量控制提供了參考。