楊麗，高增明，張福娟，杜國軍，孫敬明，王存堂*

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(朝陽師范高等專科學(xué)校 生化工程系，遼寧 朝陽，122000)

塑料作為石油化工產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)品，因其低成本、易成形、疏水性和生物惰性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于食品包裝[1]。但有限的不可再生資源、環(huán)境污染及食品安全等問題使人們對無毒、可降解的天然聚合物材料產(chǎn)生了濃厚興趣[2]。目前，研究者已經(jīng)開發(fā)了基于不同生物聚合物的食品包裝膜，如多糖(淀粉、纖維素和殼聚糖等)、蛋白質(zhì)(大豆蛋白、玉米醇溶蛋白和乳清蛋白等)和脂質(zhì)(石蠟、乙酸甘油酯和蟲膠樹脂等)[3]。這些生物基薄膜不僅作為可生物降解材料，而且作為生物活性化合物的載體，受到了廣泛關(guān)注[4]。在各種生物聚合物中，殼聚糖(chitosan，CS)無毒、可生物降解和優(yōu)異的成膜性能使其更適合食品包裝[5]。然而，普通CS膜的機(jī)械、抗氧化和抗菌性能較低限制了其在食品包裝行業(yè)的應(yīng)用[5]。

研究認(rèn)為天然的活性物質(zhì)，如植物多酚和精油可顯著提高CS膜的抗氧化和抑菌性能。此外，多酚類化合物可能會與殼聚糖分子鏈上的羥基或氨基形成分子間氫鍵或發(fā)生靜電相互作用，從而改變殼聚糖膜的物理性能[5-6]。例如，紫薯提取物和肉桂精油增強(qiáng)了CS膜的抗氧化和抗菌活性[7-8]，黑豆種皮提取物和山竹皮粉均可提高CS膜的機(jī)械性能和水蒸氣阻隔能力[9-10]。葡萄渣作為釀酒和葡萄汁行業(yè)的固體殘渣，占所用葡萄質(zhì)量的20%～25%[11]。傳統(tǒng)的處理方式多為堆肥或用作動物飼料，這極大浪費(fèi)了其中的天然活性物質(zhì)[11]。據(jù)報道，葡萄渣提取物富含兒茶素、表兒茶素、沒食子酸和原花青素等多酚類物質(zhì)，且展現(xiàn)出良好的抗菌、抗氧化和抗炎癥等多種生物效應(yīng)[12-13]。葡萄皮渣提取物能夠抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長[14]，降低菜籽油和大豆油的過氧化值[15]，提高雞肉和牛肉的貯藏穩(wěn)定性[16]。目前，針對葡萄渣提取物的抗氧化和抑菌能力已有了廣泛研究，其在食品保鮮中的應(yīng)用也得到了大量評價，但在CS基薄膜中加入葡萄渣乙醇提取物的研究卻未見文獻(xiàn)報道。

本研究的目的是制備用于食品包裝的CS基膜，并探究葡萄渣乙醇提取物(ethanol extract of grape pomace，EEGP)的添加量對CS膜物化性能、力學(xué)特性、分子結(jié)構(gòu)、抗氧化能力的影響。通過模擬油脂氧化實(shí)驗(yàn)，評估CS-EEGP復(fù)合膜的氧阻隔性能及抗氧化能力。此外，研究了它們作為活性食品包裝材料潛在的抑菌能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄渣(品種為赤霞珠，主要多酚類物質(zhì)為白藜蘆醇和原花青素)，甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司；殼聚糖(高黏度，>400 mPa·s)，上海麥克林生化有限公司；DPPH，上海藍(lán)季生物有限公司；ABTS，山東西亞化學(xué)股份有限公司；枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)、大腸桿菌(ATCC 8739)和金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)，齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院。豬肉脂肪，齊齊哈爾當(dāng)?shù)厥袌?。所有其他試劑均為分析純?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；GZX-9146MB電熱鼓風(fēng)干燥箱，海博訊實(shí)業(yè)有限公司；2.5 L Freeze Dry System真空冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司；GBCY01數(shù)顯膜測厚儀，浙江盛泰芯電子科技有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；CR-10 Plus色差儀，杭州柯盛行儀器有限公司；TA.XT plusC質(zhì)構(gòu)分析儀，英國Stable Micro System公司；S-4300掃描電子顯微鏡，日本日立株式會社；Spotlight 400紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司；SmartLab X-射線衍射儀，日本理學(xué)公司；AIE-200脈沖封口機(jī)，美國國際電動公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EEGP的制備

EEGP是根據(jù)劉蕓等[14]的方法制備的，并稍加修改。葡萄渣在50 ℃恒溫條件下干燥8 h，粉碎并過100目篩得到葡萄渣粉。取葡萄渣粉100 g浸于500 mL 70%乙醇溶液中，室溫下浸提2 h。將提取液以6 000 r/min離心10 min，所得沉渣以上述方法再次提取。合并2次上清液并在50 ℃下減壓濃縮。所得濃縮液在-40 ℃真空干燥48 h。凍干粉末貯存-20 ℃下備用。

1.3.2 CS-EEGP膜的制備

CS-EEGP膜是根據(jù)RIAZ等[4]的流延法制備的，稍作修改。將2 g CS溶于100 mL 1%的醋酸溶液中，攪拌4 h使 CS完全溶解。再加入1 g甘油作為增塑劑，攪拌30 min。之后，將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EEGP(0%，1%，3%，5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù),基于CS的質(zhì)量，下同)加入到CS成膜溶液中，攪拌30 min。膜溶液中的氣泡通過真空脫氣(0.1 MPa，2 h)去除。將相同體積(30 mL)的CS-EEGP溶液倒在15 cm×15 cm的有機(jī)玻璃板上。在25 ℃放置12 h后，移到60 ℃干燥箱中干燥2 h，小心揭下CS-EEGP膜。將含有0%、1%、3%、5%EEGP的CS薄膜分別指定為CS、CS-EEGP1、CS-EEGP3和CS-EEGP5膜，并在放有飽和溴化鈉溶液的干燥器中(56%相對濕度，25 ℃)平衡48 h。

1.3.3 膜厚度的測定

使用數(shù)顯膜測厚儀測量薄膜厚度。取每片膜的5個隨機(jī)位置的厚度平均值作為膜厚度。

1.3.4 膜含水量的測定

根據(jù)RIAZ等[17]的方法測定薄膜含水量。從干燥器中取出薄膜并切成2 cm×2 cm的片狀。稱取膜片初始質(zhì)量M1，然后在105 ℃干燥至恒重，測得質(zhì)量M2。薄膜含水量的計算方法如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 膜水溶性的測定

參照RIAZ等[17]的方法，將薄膜切成2 cm×2 cm的片狀并在105 ℃干燥至恒重，測得質(zhì)量M1。然后，將它們放入裝有50 mL蒸餾水的100 mL燒杯中并在室溫靜置24 h。取出并在105 ℃干燥至恒重，測得質(zhì)量M2。薄膜水溶性的計算方法如公式(2)所示：

(2)

1.3.6 膜水蒸氣滲透性的測定

CS基膜水蒸氣滲透性(water vapor permeability，WVP)通過CRIZEL等[18]的重量分析法測定，并稍作修改。將薄膜(直徑10 cm)密封在直徑為6.1 cm的塑料杯的頂部，塑料杯內(nèi)以無水氯化鈣顆粒填充(維持0%的相對濕度)。稱重后將杯子放入裝有飽和氯化鈉溶液的干燥器中，保持恒定的濕度(75%)和溫度(25 ℃)。每隔24 h記錄1次杯子質(zhì)量的變化，連續(xù)7 d。薄膜WVP的計算方法如公式(3)所示：

(3)

式中：W，塑料杯的總質(zhì)量增加量，g；x，膜厚度，mm；A，滲透面積，m2，t，經(jīng)過的時間，s；ΔP，薄膜的分蒸汽壓差(25 ℃時為3 200 Pa)，g/(m·s·Pa)。

1.3.7 膜顏色的測定

按照GB/T 7921—2008的方法用色差儀測定膜片的顏色參數(shù)[19]。亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值用于表征膜顏色。使用前經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)白板校準(zhǔn)(L=91.8，a=-2.2，b=-2.7)。根據(jù)RIAZ等[4]的方法計算總色差(ΔE)、黃度指數(shù)(yellowness index，YI)和白度指數(shù)(whiteness index，WI),計算如公式(4)～公式(6)所示：

(4)

(5)

(6)

1.3.8 膜透光率和不透明度的測量

根據(jù)RIAZ等[17]的方法測量薄膜透光率和不透明度。將薄膜切成1 cm×3 cm的長條狀，使用紫外分光光度計測量薄膜在600 nm處吸收度值。此外，不透明度的計算方法如公式(7)所示：

(7)

式中：A600，薄膜在600 nm處的吸光度值；x，膜厚度，mm。

1.3.9 膜機(jī)械性能的測定

根據(jù)GB/T 1040.3—2006的方法[20]，使用質(zhì)構(gòu)分析儀對薄膜的機(jī)械性能進(jìn)行了評估。薄膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率的計算方法分別如公式(8)、公式(9)所示：

(8)

(9)

式中：F，最大拉伸強(qiáng)度，N；x，膜厚度，mm；W，膜寬度，mm；ΔL，膜斷裂時的伸長量，mm；L0，膜的初始長度，mm。

1.3.10 掃描電子顯微鏡

通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察薄膜表面和橫截面的微觀結(jié)構(gòu)。在5 kV加速電壓和2 000倍或1 000倍放大倍數(shù)下獲得了樣品的SEM照片。在此之前，薄膜在液氮中破碎，然后濺射鍍金。

1.3.11 傅里葉變換紅外光譜

根據(jù)WANG等[9]的方法，使用傅立葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)/近紅外光譜(near infrared spectrum instrument，NIRS)對薄膜的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在4 000～500 cm-1頻率范圍內(nèi)掃描16次獲得每個頻譜結(jié)果。

1.3.12 X射線衍射

根據(jù)GUO等[21]描述的方法，通過X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)分析薄膜的結(jié)晶特征。儀器參數(shù)設(shè)置為45 kV，200 mA，衍射角2θ為5°～60°，掃描速度4°/min。

1.3.13 膜的DPPH自由基清除活性

采用RIAZ等[22]的方法測定了CS基膜的DPPH自由基清除活性，并稍作修改。將10 mg薄膜混合到3 mL 0.2 mmol/L甲醇DPPH溶液中，并在黑暗環(huán)境中靜置1 h。然后，測量反應(yīng)混合物在517 nm處的吸光度。根據(jù)公式(10)計算膜的DPPH自由基清除活性：

(10)

式中：A0，甲醇DPPH溶液的吸光度；A1，薄膜反應(yīng)混合物的吸光度。

1.3.14 膜的ABTS陽離子自由基清除活性

膜的抗氧化能力通過清除ABTS陽離子自由基的方法進(jìn)行評估[22]。將ABTS溶解在20 mmol/L pH 4.5的乙酸緩沖溶液中，以獲得7 mmol/L ABTS溶液。該溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，然后在室溫黑暗環(huán)境靜置12～16 h。測量前使用乙酸緩沖溶液將穩(wěn)定的ABTS陽離子自由基貯存液吸光度調(diào)整為0.70±0.02。取10 g薄膜和3 mL ABTS工作液混合并孵育6 min，在734 nm處測量吸光度。膜的ABTS自由基清除活性通過公式(11)計算：

(11)

式中：A0，ABTS工作液的吸光度；A1，薄膜反應(yīng)混合物的吸光度。

1.3.15 豬油包裝

根據(jù)MENG等[23]的方法將豬油從豬肉脂肪中提煉并包裝在薄膜袋中，每袋6 g。薄膜袋的邊界用脈沖密封機(jī)密封。然后將其在(60±1)℃的電鼓風(fēng)干燥箱中貯存7 d。每24 h測定1次豬油的過氧化值(peroxide value，POV)，并與暴露在空氣中的豬油進(jìn)行比較。

1.3.16 豬油POV的測定

根據(jù)MENG等[23]的方法稍加修改測定豬油的POV。將3 g豬油加入含有30 mLV(氯仿)∶V(乙酸)=2∶3混合溶液的碘量瓶中。輕輕搖動碘量瓶使豬油完全溶解。然后將加入1 mL飽和碘化鉀溶液的碘量瓶轉(zhuǎn)移到暗室中。3 min后，加入100 mL蒸餾水并搖勻，立即用0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色。再加入1 mL淀粉指示劑，繼續(xù)進(jìn)行滴定并搖動碘量瓶，直到藍(lán)紫色完全消失。同時進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)。POV的計算如公式(12)所示：

(12)

式中：V，樣品消耗的硫代硫酸鈉溶液體積，mL；V0，試劑空白實(shí)驗(yàn)消耗的硫代硫酸鈉溶液體積，mL；c，消耗的硫代硫酸鈉溶液濃度，mol/L；m，豬油質(zhì)量，g。

1.3.17 微生物分析

采用圓盤擴(kuò)散法測定薄膜的抗菌活性[24]?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌用無菌0.5%氯化鈉肉湯進(jìn)行擴(kuò)增，金黃色葡萄球菌用無菌7.5%氯化鈉肉湯進(jìn)行擴(kuò)增。使用前，用無菌生理鹽水將獲得的細(xì)菌懸浮液的細(xì)胞密度調(diào)整為104CFU/mL。將薄膜切割成直徑為10 mm的圓盤，并在紫外線照射下滅菌10 min。之后將圓盤置于涂有0.2 mL細(xì)菌稀釋液的瓊脂培養(yǎng)基上，并在37 ℃下培養(yǎng)48 h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，抑菌圈的大小反映了薄膜的抑菌效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)一式3份。使用IBM SPSS統(tǒng)計程序進(jìn)行統(tǒng)計分析。在95%置信水平下，采用雙向方差分析(analysis of variance，ANOVA)確定各組之間的顯著差異。數(shù)據(jù)平均值之間的顯著差異通過鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜厚度

膜厚度對薄膜的機(jī)械性能、水蒸氣透過率、紫外線和光的阻隔性能具有較大的影響，是一個重要參數(shù)[25]。膜厚度不僅受膜材的性質(zhì)、干燥條件和制備方法的影響，還受添加物種類的影響[26-27]。如表1所示，EEGP的加入顯著提高了CS膜的厚度(P<0.05)。隨著EEGP濃度的增加，CS基膜的厚度由0.047 mm增加到0.093 mm。膜厚度的增加與引入膜基質(zhì)中的固體物含量增加有關(guān)[28]。另一方面，EEGP多羥基的結(jié)構(gòu)促進(jìn)了多酚通過分子間相互作用(氫鍵或共價鍵)與一個以上的CS分子結(jié)合。其結(jié)果是CS膜更加致密，導(dǎo)致厚度增加。

表1 含不同濃度EEGP的CS基膜的物理性質(zhì)Table 1 Physical properties of CS-based films with different concentration of EEGP

2.2 含水量和水溶性

如表1所示，添加EEGP后CS膜的含水量和水溶性均降低。由于CS分子鏈含有豐富的親水基團(tuán)，如—OH和—NH2，所以CS膜的含水量最高[29]。相反，EEGP的引入導(dǎo)致CS膜含水量降低，這是因?yàn)镋EGP中花青素與CS親水基團(tuán)強(qiáng)烈相互作用限制了CS與水分子形成分子間氫鍵[30]。因此，隨著EEGP濃度的增加，CS-EEGP薄膜的含水量顯著降低(P<0.05)。CS膜展現(xiàn)出最高的水溶性，這歸因于甘油和CS的親水基團(tuán)與水的結(jié)合能力[30]。隨著EEGP的加入，CS-EEGP薄膜的水溶性逐漸降低。與CS膜相比(16.81%)，CS-EEGP5膜的水溶性降低了21.89%，差異顯著(P<0.05)。CS-EEGP膜水溶性的降低與添加的天然物質(zhì)有部分不易溶于水有關(guān)。

2.3 WVP

WVP反映了薄膜對水蒸氣的阻隔性能[5]。結(jié)果如表1所示，CS-EEGP膜的WVP小于CS膜。當(dāng)EEGP的添加量從0增加到3%，CS膜的WVP由6.15×10-12g/(m·s·Pa)下降至3.54×10-12g/(m·s·Pa)。這表明EEGP的加入可顯著提高CS膜的水蒸氣阻隔性能。這是由于酚類化合物與CS鏈之間的分子間相互作用形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此外，薄膜厚度的增加也是影響CS膜WVP的重要因素[27]。當(dāng)EEGP添加量增加到5%，CS-EEGP5膜的WVP開始上升，但仍低于CS膜。這是因?yàn)镋EGP在CS膜中的分散不均勻造成部分致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞[30]，這種分散不均勻的現(xiàn)象在圖1中可觀察到?？偟膩碚f，EEGP的加入降低了CS膜的WVP。該結(jié)果優(yōu)于添加了黑豆種皮提取物[12.58×10-11g/(m·s·Pa)][9]、韭菜根提取物[7.81×10-11g/(m·s·Pa)][4]和山竹果皮粉[2.12×10-10g/(m·s·Pa)][10]的CS基薄膜。

a-CS；b-CS-EEGP1；c-CS-EEGP3；d-CS-EEGP5圖1 CS膜和CS-EEGP膜Fig.1 CS film and CS-EEGP films

2.4 膜的顏色、透光率和不透明度

薄膜的物理外觀，尤其是顏色，通常會影響消費(fèi)者對薄膜包裝食品的接受程度[6]。從視覺上看，CS膜為無色透明，隨著EEGP含量的增加逐漸變暗(圖1)。所有測試薄膜表面的顏色參數(shù)如表2所示。結(jié)果表明，添加EEGP后，CS膜L*和WI顯著降低，a*、b*、ΔE和YI顯著增加(P<0.05)。EEGP為紫紅色，但CS-EEGP膜呈現(xiàn)更直觀的灰色，這是由于EEGP中花青素的結(jié)構(gòu)和顏色發(fā)生了變化[26,30]。當(dāng)EEGP含量達(dá)到5%時，CS-EEGP5薄膜的b*和YI值較高，L*和WI值較低。同時，ΔE也達(dá)到最大，CS-EEGP5薄膜變得更暗。

可見光和紫外光作為引發(fā)氧自由基的因素之一，會加速食品的氧化變質(zhì)，影響食品的品質(zhì)[18,23]。測定的薄膜的阻光性能結(jié)果如表2所示。CS膜展現(xiàn)出較差紫外光阻隔性能，EEGP的加入可顯著改變這種性能。隨著EEGP添加量的不斷增大，CS-EEGP膜的紫外光透射率逐漸減小。CS膜阻擋紫外光能力的提高與EEGP所富含的花青素有關(guān)，其能吸收波長為270～280 nm和465～550 nm的光。此外，與CS膜相比，CS-EEGP5膜的不透明度增高48.65%。該結(jié)果與EEGP的加入使CS膜變暗有關(guān)。

表2 含不同濃度EEGP的CS基膜的顏色、透光率和不透明度Table 2 Color, transmittance and opacity of CS-based films with different concentration of EEGP

2.5 膜的機(jī)械性能

機(jī)械性能反映了薄膜的機(jī)械阻力和柔韌性。通過抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率兩個重要參數(shù)來評估薄膜的結(jié)構(gòu)完整性和阻隔性能[5]。在實(shí)際應(yīng)用中薄膜的完整性和可變形性對食品包裝、運(yùn)輸和貯藏具有很大的影響[22]。此外，影響復(fù)合膜機(jī)械性能的因素有以下幾種：天然活性物質(zhì)的類型和含量、生物基材的種類以及兩者之間的相互作用[5]。如表3所示，EEGP的加入顯著降低了CS膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率(P<0.05)。CS膜機(jī)械性能更強(qiáng)(35.68 MPa和40.34%)，主要是CS分子中的大量活性基團(tuán)(如—OH 和—NH2)形成了分子間氫鍵[21]。CS-EEGP膜機(jī)械阻力和柔韌性的降低與酚類化合物阻斷CS膜中的鏈-鏈相互作用有關(guān)[30]。LIU等[6]指出，CS膜的機(jī)械性能會受到薄膜網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)、加入的活性化合物的類型和含量以及分子間作用力的極大影響。

表3 不同EEGP濃度下CS基膜的力學(xué)性能Table 3 Mechanical properties of CS-based films with different concentration of EEGP

2.6 SEM

EEGP的分布和CS基膜的形貌如圖1所示。CS膜平滑完整，無孔隙和裂紋。EEGP的加入并未破壞CS膜結(jié)構(gòu)的完整性。但是，當(dāng)EEGP添加量從1%增加到5%時，CS-EEGP膜中聚集物增多。

通過掃描電鏡對CS-EEGP膜微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步觀察。結(jié)果表明，CS膜的表面和橫截面光滑且連續(xù)(圖2)。EEGP的加入并未顯著改變CS膜的微觀結(jié)構(gòu)。隨著EEGP含量的增加，CS-EEGP膜表面的白點(diǎn)增多，這是因?yàn)镃S膜中聚集物增多。這種聚集物是因?yàn)槎喾优cCS的交聯(lián)。此外，CS-EEGP膜的橫截面緊密且連續(xù)，并未觀察到氣孔或者縫隙。但是添加了EEGP的CS膜上側(cè)出現(xiàn)帶狀絮狀物。該條帶隨著EEGP含量的增加而變寬。這是CS-EEGP膜表面出現(xiàn)白點(diǎn)的原因，CS膜內(nèi)部絮狀物因聚集而形成突起。RIAZ等[4]將這種聚集歸結(jié)于多酚的親水性。

a-CS膜表面；b-CS-EEGP1薄膜表面；c-CS-EEGP3薄膜表面； d-CS-EEGP5薄膜表面；e-CS膜橫截面；f-CS-EEGP1薄膜截面； g-CS-EEGP3薄膜截面；h-CS-EEGP5薄膜橫截面圖2 CS基膜表面和橫截面的SEM顯微照片F(xiàn)ig.2 SEM micrographs of the surface and cross-section of CS-based films

2.7 FT-IR光譜

圖3 CS膜、CS-EEGP膜和EEGP的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectras of CS film, CS-EEGP film and EEGP

2.8 XRD圖譜

CS膜和CS-EEGP膜的X射線衍射圖譜如圖4所示。CS的結(jié)晶特征為非結(jié)晶、水合結(jié)晶和無水結(jié)晶[2]。在CS膜的XRD圖譜上，CS膜在2θ=8.5°、11.5°、17.4°、18.0°和24.4°處出現(xiàn)5個衍射峰，表明CS薄膜具有半結(jié)晶特性。CS薄膜在2θ=8.5°、11.5°處出現(xiàn)衍射峰，這歸因于水合物晶體結(jié)構(gòu)，2θ=24.4°處的衍射峰對應(yīng)于非晶態(tài)結(jié)構(gòu)[9]。EEGP的圖譜在21.0°左右有一寬峰對應(yīng)EEGP的非晶態(tài)。值得注意的是，隨著EEGP濃度的增加，CS-EEGP膜的衍射峰強(qiáng)度明顯降低。當(dāng)EEGP添加量增加到5%時，衍射峰消失并趨于平緩，表明薄膜的結(jié)晶度較低。這表明EEGP具有降低CS結(jié)晶度的作用。這與CS鏈與多酚之間新形成的分子間氫鍵有關(guān)。ZHANG等[10]認(rèn)為結(jié)晶度的增加與添加物聚集有關(guān)，例如在CS膜中聚集的山竹皮粉展現(xiàn)出更強(qiáng)的衍射能力。這些不同的結(jié)果表明富含多酚的CS基膜的結(jié)晶性質(zhì)會受提取物中多酚的含量和組成的影響[28]。

圖4 CS膜、CS-EEGP膜和EEGP的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of CS film, CS-EEGP films and EEGP

2.9 膜的抗氧化活性

外界因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的游離自由基是導(dǎo)致食品氧化變質(zhì)的重要因素，因此活性食品包裝膜應(yīng)具備抗氧化能力[10]。EEGP中的多酚以花青素為主，其多羥基結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的供氫能力[10-11]。因此，將EEGP結(jié)合到CS膜中制備活性食品包裝膜用以保護(hù)食品免受氧化損傷，延長食品貨架期。CS基膜的自由基清除活性通過DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率來評估。如圖5所示，CS-EEGP膜的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力呈劑量依賴性。隨著EEGP含量的增加，CS-EEGP膜對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力顯著提高(P<0.05)。CS膜清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的能力分別為12.62%和15.91%。與CS膜相比，CS-EEGP5膜清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的能力分別提高了20.54%和28.92%。CS基膜抗氧化活性的提高主要是由于天然提取物中的多酚能夠通過提供苯酚氫清除自由基[24]。MENG等[23]認(rèn)為DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的高清除率與多酚在膜材中的良好釋放效果有關(guān)。

圖5 CS基膜對DPPH和ABTS自由基的清除活性Fig.5 Scavenging activities of the CS-based films on DPPH and ABTS radicals 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.10 豬油的POV

圖6表示被CS基薄膜包裹的豬油的氧化程度，未包裝豬油作為對照組。與對照組相比，CS基膜包裹的豬油POV顯著降低(P<0.05)。此外，當(dāng)CS膜中EEGP的含量從0%增加到3%時，豬油的POV降低。第7天，與對照組和CS膜相比，CS-EEGP3膜的POV分別降低了88.27%和33.93%。這與圖2觀察到的CS-EEGP3膜結(jié)構(gòu)致密有關(guān)，CS-EEGP3膜具有優(yōu)異的氧阻隔性能，這將防止豬油被活性氧氧化。此外，CS-EEGP3膜釋放出的多酚類物質(zhì)也可減緩豬油的氧化酸敗。然而，CS-EEGP5膜并沒有表現(xiàn)出更好的延緩豬油氧化的效果。貯存6 d后，CS-EEGP5膜包裹的豬油POV高于CS膜，但明顯低于對照組(P<0.05)。這是因?yàn)镃S-EEGP5膜致密結(jié)構(gòu)的破壞以及CS-EEGP膜加熱過程中失水導(dǎo)致的透氧性增加[23]。盡管如此，CS-EEGP5膜的自由基清除能力仍能減緩豬油的氧化降解。MENG等[23]研究了桂皮膠/槐花提取物復(fù)合膜得出了與我們相似的結(jié)論，即添加天然提取物具有減緩豬油氧化的效果。總的來說，CS-EEGP膜具有良好的阻氧性能和抗氧化能力，在食品包裝行業(yè)具有較好的應(yīng)用前景。

圖6 CS基膜包裹豬油的POVFig.6 POV of lard packed by CS-based films

2.11 膜的抑菌活性

由表4可知，所有膜對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抑制作用。CS膜抑菌圈直徑最小代表其抑菌能力最弱，而EEGP的引入提高了CS膜的抑菌能力。隨著EEGP含量的增加，CS-EEGP膜對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌區(qū)直徑逐漸增大，分別從12.27 mm和11.27 mm增大到13.23 mm和16.83 mm。與CS膜相比，CS-EEGP5 膜對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑顯著增加(P<0.05)。CS膜表現(xiàn)出的抗菌特性與CS是一種陽離子多糖有關(guān)[10]。其游離的氨基與細(xì)胞膜相互作用導(dǎo)致細(xì)胞液滲出，細(xì)胞死亡。而EEGP中多酚的存在不僅可以增加細(xì)胞膜通透性，還可干擾微生物遺傳物質(zhì)合成(如與DNA/RNA結(jié)合)，從而達(dá)到抑制微生物生長[10]。但是，CS-EEGP 膜對大腸桿菌無明顯抑制效果(P>0.05)，這與3種食源性病原體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。ZHANG等[10]認(rèn)為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生理和代謝方面的差異是造成生物活性膜對革蘭氏陽性菌的抗菌能力高于革蘭氏陰性菌的原因?？偟膩碚f，CS-EEGP5膜對抑制微生物生長具有較好的效果。

表4 CS膜和CS-EEGP膜對3種食源性致病菌的抑菌活性Table 4 Antimicrobial activity of CS and CS-EEGP films against three foodborne pathogens

3 結(jié)論

將EEGP引入CS基材制備了活性包裝膜。EEGP的加入顯著提高了CS膜的厚度和不透明度，降低了CS膜的含水量、水溶性和機(jī)械性能。FT-IR光譜表明EEGP和CS之間形成了分子間氫鍵，這大大降低了CS-EEGP膜的結(jié)晶度。此外，CS-EEGP膜致密的微觀結(jié)構(gòu)使CS-EEGP3膜具有良好的水蒸氣阻隔能力和阻氧能力。同時，EEGP豐富的原花青素使CS-EEGP膜表現(xiàn)出優(yōu)異紫外可見光阻隔能力、抗氧化和抑菌能力。在貯藏第7天，包裹了CS-EEGP3膜豬油擁有更低的POV。這些結(jié)果表明，EEGP的加入可以改善CS膜的物化性能和生物活性。此外，需要進(jìn)一步評價活性包裝膜中活性組分活性作用的時效性，研究其對防止食品的氧化和腐敗，延長食品貨架期的影響。