祁亞勁，賀禹豐，楊羽倩，石劉婷，詹語，魯佳欣，郭敏，王慧玲，趙建新，張灝，王剛*，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(蘇州市立醫(yī)院, 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，南京醫(yī)科大學(xué) 姑蘇學(xué)院，江蘇 蘇州，215002)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常發(fā)的一種異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病，全球范圍內(nèi)育齡婦女患病率約8%～13%[1]，主要臨床表現(xiàn)為肥胖、月經(jīng)失調(diào)、雄激素過多、胰島素抵抗、卵巢多囊樣變和代謝性疾病[2-5]。其病因可能與遺傳因素、環(huán)境因素、雄激素代謝異常、內(nèi)分泌異常、腸道菌群等多方面相關(guān)[6]。腸道菌群被稱為人體的“第二器官”，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后能夠通過適應(yīng)腸道環(huán)境，使其數(shù)量和種類在腸道形成一道屏障，防止脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)進(jìn)入體循環(huán)，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[7]。而其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAS)可被腸黏膜細(xì)胞吸收，確保腸黏膜正常的屏障作用[8]。

已有研究證明，移植健康大鼠腸道菌群的PCOS大鼠血清中雄激素水平下降，發(fā)情周期改善，卵巢功能恢復(fù)正常[9]，這表明改變腸道菌群可以影響PCOS癥狀，靶向腸道菌群的PCOS療法具有很大應(yīng)用前景。益生菌是廣為應(yīng)用的腸道菌群調(diào)節(jié)劑。目前研究表明，攝入益生菌可以緩解PCOS癥狀：AHMADI等[10]發(fā)現(xiàn)，益生菌的攝入可以降低PCOS婦女體重、血糖、甘油三酯、超低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)膽固醇水平；HE等[11]通過對(duì)PCOS大鼠進(jìn)行益生菌干預(yù)，發(fā)現(xiàn)特定益生菌可以通過調(diào)節(jié)性激素相關(guān)腸道菌群來緩解大鼠PCOS癥狀。石劉婷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳可以改善PCOS大鼠的卵巢病變，降低其血清中睪酮水平，提高其血清中雌二醇水平。為了進(jìn)一步研究植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS的緩解作用是否與腸道菌群調(diào)節(jié)有關(guān)，本研究分析了植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠腸道菌群及其代謝物短鏈脂肪酸的影響，以期尋找植物乳桿菌發(fā)酵豆乳緩解PCOS的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，嘉祥永勝食品有限公司；蔗糖，市售；來曲唑片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)，上海麥克林生化科技有限公司；達(dá)英-35，拜爾醫(yī)藥保健有限公司；Fast DNA Spin Kit for Feces試劑盒，美國MP Biomedicals公司；DNA Gel/PCR Purification Midiprep kit試劑盒，美國BIOMIGA公司；植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5，江南大學(xué)生物技術(shù)中心菌種保藏庫。

1.2 儀器與設(shè)備

PB300-N電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5804R Eppendorf高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司；超低溫冰箱、氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司；高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序儀，美國Illumina公司。

1.3 發(fā)酵豆乳的制備

不同類型的發(fā)酵豆乳制備參照石劉婷等[12]的方法進(jìn)行。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參照石劉婷等[12]設(shè)計(jì)。詳細(xì)處理及分組見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理Table 1 Grouping and treatment of experimental animals

1.5 糞便中短鏈脂肪酸的測(cè)定

將50 mg凍干后的糞便樣品置于1.5 mL EP管中，加入500 μL飽和NaCl溶液浸泡糞便，30 min后，采用高通量組織研磨器將糞便破碎至無明顯塊狀物。加入20 μL 10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液進(jìn)行酸化，加入800 μL乙醚用以萃取短鏈脂肪酸，14 000 r/min離心15 min。離心后取上層乙醚相，將其加入到裝有2 mL 0.25 g無水硫酸鈉的EP管中，14 000 r/min離心15 min。將上清液加入到氣相瓶中，采用GC-MS分析乙酸(acetate)、丙酸(propionate)、異丁酸(isobutyric acid)、丁酸(butyrate)、異戊酸(isovaleric acid)及戊酸(valeric acid)的含量。

1.6 DNA提取和PCR擴(kuò)增

大鼠麻醉處死前，收集新鮮糞便于無菌塑料管中，-80 ℃快速保存。采用Fast DNA Spin Kit for Feces 試劑盒對(duì)糞便的菌群DNA進(jìn)行提取，并對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用DNA Gel/PCR Purification Midiprep kit試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.7 腸道菌群高通量測(cè)序

對(duì)PCR產(chǎn)物以等摩爾量進(jìn)行定量和匯總；使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序；采用QIIME對(duì)16S rRNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對(duì)原始reads進(jìn)行過濾、合并、多路分離以進(jìn)行質(zhì)量控制，使用與UCLUST 97%的相似性截止將其聚類為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。最后，利用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目RDP對(duì)每個(gè)OTU的分類進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖；將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Fisher′s LSD檢驗(yàn))，對(duì)不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))；采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行顯著性分析采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

如圖1所示，與空白組相比，來曲唑處理的PCOS大鼠糞便中6種短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的水平均有所下調(diào)；由圖1-c、圖1-e可知，植物乳桿菌CCFM1019、LP5發(fā)酵豆乳上調(diào)了PCOS大鼠異丁酸、異戊酸水平，但與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。植物乳桿菌LP4發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠糞便中短鏈脂肪酸水平無明顯影響。

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS腸道菌群的影響

2.2.1 腸道菌群多樣性分析

通過Observed spieces、Chao 1、Shannon、Simpson指數(shù)評(píng)估腸道菌群的α多樣性。由圖2可知，空白組與模型組Observed spieces、Chao 1、Shannon、Simpson指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，CCFM1019組顯著提高了Observed spieces(P<0.001)、Chao 1(P<0.01)、Shannon(P<0.05)、Simpson(P<0.05)指數(shù)，LP4組顯著提高了Observed spieces(P<0.01)、Chao 1(P<0.01)、Shannon指數(shù)(P<0.05)，LP5組顯著提高了Observed spieces、Chao 1指數(shù)(P<0.05)，說明3種植物乳桿菌發(fā)酵豆乳能夠提高PCOS大鼠腸道菌群的物種。

多樣性基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)軸分析(principal coordinate analysis，PCoA)(圖3)結(jié)果表明，空白組與模型組之間腸道菌群在分布上具有顯著性差異；植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳的干預(yù)對(duì)PCOS大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)具有一定相似性，但與模型組相比，組成上具有顯著性差異。進(jìn)一步非參數(shù)多元方差分析(Adonis)分析顯示，3株植物乳桿菌發(fā)酵豆乳干預(yù)后的PCOS大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)上無顯著性差異且明顯區(qū)別于空白組與模型組的腸道菌群(表2)。這提示，3株植物乳桿菌發(fā)酵豆乳的干預(yù)對(duì)PCOS大鼠腸道菌群造成影響，雖然未能使PCOS大鼠腸道菌群恢復(fù)至正常，但是結(jié)合3株植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠癥狀的緩解作用，我們認(rèn)為，植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳能夠?qū)COS大鼠腸道菌群調(diào)節(jié)到一種新的穩(wěn)態(tài)，而這種穩(wěn)態(tài)有利于PCOS大鼠病理表型的恢復(fù)。

表2 Adonis分析數(shù)據(jù)Table 2 Data analysis of Adonis

2.2.2 腸道菌群組成分析

研究考察了門水平的菌群變化，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的腸道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes構(gòu)成(圖4)。與空白組相比，來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠Firmicutes、Bacteroidetes水平未發(fā)生明顯改變。與模型組相比，植物乳桿菌CCFM1019發(fā)酵豆乳降低了Firmicutes相對(duì)豐度并提高了Bacteroidetes相對(duì)豐度，從而降低了Firmicutes/Bacteroidetes值但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；植物乳桿菌LP4、LP5發(fā)酵豆乳的干預(yù)效果與CCFM1019組相反，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

各實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道菌群屬水平組成如圖6所示。與模型組相比，植物乳桿菌CCFM1019發(fā)酵豆乳顯著降低了Lactobacillus(P<0.001)、PrevotellaceaeUCG-001(P<0.01)相對(duì)豐度，同時(shí)降低了RuminococcaceaeUCG-014相對(duì)豐度，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；植物乳桿菌LP4發(fā)酵豆乳顯著降低了Lactobacillus(P<0.01)、PrevotellaceaeUCG-001(P<0.01)相對(duì)豐度，同時(shí)降低了RuminococcaceaeUCG-014、Parabacteroides相對(duì)豐度，提高了Lachnospira、Anaerostipes相對(duì)豐度，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；植物乳桿菌LP5發(fā)酵豆乳顯著降低了Lactobacillus(P<0.05)、PrevotellaceaeUCG-001(P<0.001)相對(duì)豐度，同時(shí)降低了RuminococcaceaeUCG-014、Parabacteroides相對(duì)豐度，提高了Anaerostipes相對(duì)豐度，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖7)。

2.3 腸道菌群與短鏈脂肪酸、性激素水平的相關(guān)性分析

前期研究了植物乳桿菌發(fā)酵豆乳的干預(yù)對(duì)性激素水平的影響[12]。本研究進(jìn)一步對(duì)腸道菌群和短鏈脂肪酸、性激素水平相關(guān)性進(jìn)行了Spearman分析。由圖8可知，Lactobacillus的相對(duì)豐度與睪酮呈正相關(guān)，并且相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PrevotellaceaeUCG-001的相對(duì)豐度與促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)呈正相關(guān)，并且相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RuminococcaceaeUCG-014的相對(duì)豐度與GnRH呈正相關(guān)，與異戊酸水平呈負(fù)相關(guān)，且2種相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Lachnospira的相對(duì)豐度與雌二醇呈正相關(guān)(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組大鼠性激素水平見石劉婷等[12]的研究。

a-乙酸水平；b-丙酸水平；c-異丁酸水平；d-丁酸水平；e-異戊酸水平；f-戊酸水平圖1 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠糞便中短鏈脂肪酸水平的影響Fig.1 Effect of L.plantarum fermented soymilk on fecal SCFAs of PCOS rats

a-Observed spieces指數(shù)；b-Chao 1指數(shù)；c-Shannon指數(shù)；d-Simpson指數(shù)圖2 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.2 Effect of L.plantarum fermented soymilk on α diversity of gut microbiota in PCOS rats 注：*與模型組比較，P<0.05；**與模型組比較，P<0.01；***與模型組比較，P<0.001；#與空白組相比，P<0.05；##與空白組比較，P<0.01； ###與空白組比較，P<0.001(下同)

圖3 基于Bray-Curtis距離的PCoAFig.3 PCoA analysis by the Bray-Curtis

圖4 各門水平所占比例Fig.4 The proportion of each phylum level

a-Firmicutes相對(duì)豐度；b-Bacteroidetes相對(duì)豐度； c-Firmicutes/Bacteroidetes比值圖5 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠腸道菌群門 水平的影響Fig.5 Effect of L. plantarum fermented soymilk on the phylum level of gut microbiota in PCOS rats

圖6 各屬水平所占比例Fig.6 The proportion of each genus level

3 結(jié)論

近年來的研究表明，PCOS患者與健康人體之間腸道菌群存在顯著差異[13-14]，腸道菌群失調(diào)可能通過影響微生物相關(guān)物質(zhì)及代謝物，包括膽汁酸[15]、短鏈脂肪酸[16]和LPS[17]等觸發(fā)PCOS癥狀。通過腸道微生物調(diào)節(jié)劑(如益生菌)的干預(yù)可以改善腸道菌群失調(diào)以緩解POCS癥狀[16,18]。本研究通過對(duì)PCOS大鼠灌胃植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳發(fā)現(xiàn)：3種植物乳桿菌發(fā)酵豆乳顯著提高了PCOS大鼠腸道菌群的α-多樣性，且干預(yù)后大鼠的腸道菌群與模型組相比具有顯著差異。植物乳桿菌CCFM1019

a-Lactobacillus相對(duì)豐度；b-Prevotellaceae UCG-001相對(duì)豐度；c-Ruminococcaceae UCG-014相對(duì)豐度；d-Anaerostipes相對(duì)豐度； e-Parabacteroides相對(duì)豐度；f-Lachnospira相對(duì)豐度圖7 植物乳桿菌發(fā)酵豆乳對(duì)PCOS大鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.7 Effect of L. plantarum fermented soymilk on the genus level of gut microbiota in PCOS rats

圖8 短鏈脂肪酸、性激素與不同屬的相關(guān)性Fig.8 Correlation between sex hormones, SCFAs and differential genera 注：*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001

發(fā)酵豆乳表現(xiàn)出了降低Firmicutes/Bacteroidetes的趨勢(shì)。Firmicutes與Bacteroidetes的比值與肥胖密切相關(guān)[19]，因此CCFM1019發(fā)酵豆乳的干預(yù)可能有利于肥胖PCOS患者體重的下降。此外與模型組相比，3種植物乳桿菌發(fā)酵豆乳均能顯著降低Lactobacillus、PrevotellaceaeUCG-001相對(duì)豐度，同時(shí)有降低Ruminococcaceae UCG-014相對(duì)豐度的趨勢(shì)。SHERMAN等[20]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus的減少可以改善腸道屏障功能；ZHANG等[21]發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比，Prevotellaceae在肥胖人群腸道中含量豐富，這可能與其能夠發(fā)酵膳食纖維，促進(jìn)機(jī)體吸收營養(yǎng)成分有關(guān)。王萍等[22]發(fā)現(xiàn)，瘤胃球菌屬與身體代謝機(jī)制有關(guān)，HALL等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Ruminococcusgnavus與腸道慢性炎癥顯著相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，Lactobacillus的豐度與睪酮呈正相關(guān)；PrevotellaceaeUCG-001、RuminococcaceaeUCG-014的豐度與GnRH呈正相關(guān)。3種植物乳桿菌發(fā)酵豆乳可能是通過下調(diào)Lactobacillus、PrevotellaceaeUCG-001、RuminococcaceaeUCG-014相對(duì)豐度來調(diào)節(jié)睪酮、GnRH水平以緩解PCOS癥狀。

綜上所述，植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳能夠調(diào)節(jié)PCOS大鼠的腸道菌群多樣性以及特定菌群的組成，這些菌群的相對(duì)豐度與大鼠的性激素水平具有一定相關(guān)性。說明植物乳桿菌CCFM1019、LP4、LP5發(fā)酵豆乳可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來影響PCOS大鼠的性激素水平。進(jìn)一步研究3種發(fā)酵豆乳及豆乳中差異性物質(zhì)、以及這些差異物質(zhì)對(duì)腸道內(nèi)環(huán)境的影響，將有助于進(jìn)一步解析植物乳桿菌發(fā)酵豆乳緩解PCOS癥狀的機(jī)制。