陳志超，王金多，徐慶陽(yáng),2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)與L-酪氨酸(L-tyrosine，L-Tyr)、L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)同屬芳香族氨基酸，為莽草酸途徑產(chǎn)物之一[1-2]?？勺鳛樾滦吞鹞秳┌⑺拱吞鸬暮铣汕绑w[3]，也可作為抗癌藥物的載體[4]，在食品與醫(yī)藥方面具有極大的應(yīng)用價(jià)值，目前常采用微生物發(fā)酵法獲取[5]。

微生物利用葡萄糖等為碳源合成L-Phe的代謝途徑較長(zhǎng)，需要經(jīng)過(guò)糖酵解途徑(glycolytic pathway，EMP)、檸檬酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)、戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，PPP)與莽草酸途徑(shikimic acid pathway)，其中多個(gè)關(guān)鍵酶與L-Phe的合成關(guān)系密切。金屬離子作為重要的酶激活劑，其種類與用量影響到關(guān)鍵酶活力的強(qiáng)弱進(jìn)而影響到L-Phe 產(chǎn)量與糖酸轉(zhuǎn)化率。金屬離子對(duì)酶的激活/抑制作用機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜，表現(xiàn)為：不添加或添加過(guò)少的金屬離子無(wú)法對(duì)酶起激活作用，如5×10-3～10×10-3moL/L的Mg2+可激活NADH+合酶，但低于或高于此濃度均無(wú)法起到激活作用；金屬離子對(duì)酶的作用具有一定的選擇性，如Ca2+對(duì)肌球蛋白腺三磷酸起到激活作用，卻對(duì)脫羧酶有抑制作用；有時(shí)離子之間也有拮抗作用，如Ca2+可以抑制Mg2+激活的酶，再者金屬離子之間也可以相互取代，如Mn2+離子可以取代Mg2+激活的激酶[6]。核黃素(維生素B2)在生物體內(nèi)是重要輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)和黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)的合成前體[7]，F(xiàn)AD和FMN作為黃素蛋白的輔酶參與傳遞氫的有關(guān)代謝，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用[8]。磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)是細(xì)胞140多種酶的輔酶，在氨基酸的合成、相互轉(zhuǎn)化和降解等代謝反應(yīng)中起重要作用，常見的反應(yīng)包括：催化α-酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸的轉(zhuǎn)氨酶以及一系列的消旋作用、脫羧作用和羥醛反應(yīng)[9]。維生素H過(guò)量會(huì)導(dǎo)致菌體代謝旺盛[10]，生長(zhǎng)過(guò)快，出現(xiàn)糖酸轉(zhuǎn)化率大幅降低的問(wèn)題；過(guò)少或者不添加維生素H會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)較慢、生物量較低，產(chǎn)酸效率偏低等問(wèn)題。

為解決上述問(wèn)題，本研究對(duì)L-Phe發(fā)酵中使用的微量元素與生長(zhǎng)因子(Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、PLP、維生素B2、維生素H，以下統(tǒng)稱為微量元素)用量進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，以關(guān)鍵酶活力、L-Phe產(chǎn)量與糖酸轉(zhuǎn)化率等為指標(biāo)，展示了優(yōu)化后微量元素用量的優(yōu)越性，解決了微量元素用量粗放的問(wèn)題，對(duì)工業(yè)化微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-Phe大腸桿菌生產(chǎn)菌，天津科技大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉4，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 1.5，KH2PO42.0，硫酸銨2.0，維生素B11×10-3，F(xiàn)eSO4·7H2O 1×10-2，MnSO4·H2O 5×10-3，維生素H 1×10-3，酪氨酸1.5，卡那霉素20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，酵母粉4.5，蛋白胨1.5，硫酸銨2，K2HPO4·3H2O 6，酪氨酸1.2，谷氨酸1.2，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B122.5 mL/L，維生素H 0～2×10-3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0～40×10-3，MnSO4·H2O 0～25×10-3，CaCl2·2H2O 0～33×10-3，CuSO4·5H2O 0～0.7 ×10-3，CoCl2·6H2O 0～60×10-3，ZnSO40～3×10-3，維生素B20～10×10-3，PLP 0～10×10-3，卡那霉素1×10-2。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS型全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀、Agilent Technologies；752分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；OLYMPUS生物顯微鏡，日本OLYMPUS會(huì)社；S-433D氨基酸分析儀，德國(guó)賽卡姆公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取甘油保菌管中菌株置于固體斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，傳代2次。

1.4.2 搖瓶、5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[10]。

1.5 檢測(cè)與分析方法

1.5.1 pH、溶氧值、生物量、溫度值測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]。

1.5.2L-Phe及副產(chǎn)物測(cè)定

發(fā)酵液中L-Phe、丙氨酸(L-alanine,L-Ala)產(chǎn)量采用LC20AT高效液相色譜儀測(cè)定[12]，乙酸檢測(cè)參考文獻(xiàn)[13]，谷氨酸使用SBA生物傳感分析儀測(cè)定。

1.5.3 酶粗液提取

取發(fā)酵液，4 ℃、6 500 r/min低速低溫離心6 min，棄上清液，收集菌體，稱量菌體濕重。利用0.1 mol/L的Tris-HCL緩沖液沖洗菌體2次，離心后棄上清液，再次使用該溶液重懸。利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)程持續(xù)冰浴，將處理后的液體離心，取上清液即為酶粗液。

1.5.4 DAHP、CM、PDT、芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrB編碼)酶活測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14-16]，其中DAHP又稱3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabinone glycolic acid-7-phosphate synthetase，DAHP)，CM為分支酸變位酶(chorismate mutase, CM)，PDT為預(yù)苯酸脫水酶(prephenate dehydratase, PDT)。

1.5.5 酶活力定義方式

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)酶活力定義方式均為：1 g鮮重菌體在1 mL反應(yīng)體系中1 h產(chǎn)生1 μmoL產(chǎn)物定義為1個(gè)酶活力單位[μmoL/(h·g鮮重)]。

1.5.6 殘?zhí)菧y(cè)定及耗糖速率、轉(zhuǎn)化率計(jì)算

參考文獻(xiàn)[17]。

1.5.7 單因素試驗(yàn)用量表

按表1所示微量元素設(shè)置10組實(shí)驗(yàn)，每組添加單一微量元素，設(shè)置5個(gè)濃度梯度與3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3組平行實(shí)驗(yàn)平均值，特別指出，鑒于自來(lái)水中Ca2+、Mg2+離子含量較多，因此實(shí)驗(yàn)用水均為純凈水。

表1 微量元素及其用量Table 1 Trace elements and their dosage

1.5.8 正交試驗(yàn)探究部分微量元素與生長(zhǎng)因子的最適濃度

如表2所示，本部分實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)置5個(gè)因素4個(gè)水平的正交試驗(yàn)L16(54)，對(duì)起較大影響作用的PLP、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、維生素B2、CoCl2·6H2O 5種微量元素的用量通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化研究。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Level table of orthogonal experimental factors

2 結(jié)果與分析

2.1 添加單一微量元素對(duì)發(fā)酵的影響

如圖1所示，以CuSO4·5H2O、CoCl2·2H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O為例，實(shí)驗(yàn)涉及的10種微量元素對(duì)L-Phe產(chǎn)量的影響主要有4種形式：(1)CuSO4·5H2O 添加量≤0.47×10-3g/L時(shí)，產(chǎn)量較對(duì)照組(11.2 g/L)有一定提高，當(dāng)添加量達(dá)到1.17×10-3g/L時(shí)，產(chǎn)量較對(duì)照組降低了7.1%；(2)CoCl2·2H2O 質(zhì)量濃度≤6×10-3g/L時(shí)，產(chǎn)量隨添加量提高而提高，在6×10-3g/L時(shí)產(chǎn)量為14.9 g/L，較對(duì)照組提升了33.0%，當(dāng)添加量提高到8×10-3g/L時(shí)，產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯的升降趨勢(shì)，具有類似效果的還有NiCl2·6H2O、PLP、維生素B2；(3)ZnSO4、CaCl2·2H2O的添加對(duì)L-Phe的產(chǎn)量沒有明顯的影響，不具備分析意義；(4)FeSO4·7H2O添加量≤3×10-2g/L時(shí)，產(chǎn)量隨添加量的升高而升高，且在添加3×10-2g/L時(shí)產(chǎn)量為18.2 g/L，較對(duì)照組提高了62.5%，當(dāng)添加量>3×10-2g/L時(shí)，產(chǎn)量出現(xiàn)一定程度的下滑，但始終高于對(duì)照組，具有類似效果的還有MnSO4·H2O、維生素H。值得注意的是，單一添加MnSO4·H2O時(shí)發(fā)酵液顏色隨著MnSO4·H2O添加量的提高而變黑，檢測(cè)得知生成大量乙酸，因此也可以認(rèn)為添加MnSO4·H2O的實(shí)驗(yàn)組中L-Phe產(chǎn)量的下降和乙酸的積累具有直接關(guān)系。

圖1 單一微量元素對(duì)L-Phe產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of single trace element on the yield of L-phenylalanine 注：A、B、C、D指相應(yīng)微量元素不同濃度梯度

如圖2所示，F(xiàn)eSO4·7H2O、維生素H對(duì)生物量的影響較大，F(xiàn)e2+在電子傳遞、氧的傳遞、TCA循環(huán)、基因調(diào)控和DNA的生物合成等生物學(xué)過(guò)程具有重要作用[18]，因此不難解釋FeSO4·7H2O對(duì)生物量的正向作用，當(dāng)過(guò)量添加時(shí)，鐵在有氧條件下并不利于微生物生長(zhǎng)，氧氣和還原氧類可以與鐵反應(yīng)對(duì)生命產(chǎn)生破壞性的影響[19]，因此在添加量為30×10-3g/L時(shí)生物量為66.4，繼續(xù)添加時(shí)生物量降低；維生素H可在脂肪酸生物合成、氨基酸代謝和糖異生的羧化反應(yīng)中作為酶促輔因子，例如作為乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂的合成[20]，后者作為細(xì)胞膜的主要成分，是限制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素，因此維生素H的添加量越高，生物量越大，但漲幅逐漸降低，其中添加2×10-3g/L的實(shí)驗(yàn)組，生物量為62.0，較對(duì)照組提高了19%。MnSO4·H2O的添加同樣對(duì)生物量起到了促進(jìn)作用，Mn2+離子在EMP中作為多個(gè)關(guān)鍵酶的輔因子，影響糖的利用進(jìn)而影響到能量代謝，進(jìn)一步影響到微生物的生長(zhǎng)代謝，不過(guò)在Mg2+存在時(shí)，這種促進(jìn)作用并不明顯。其他微量元素相對(duì)FeSO4·7H2O、維生素H、MnSO4·H2O對(duì)生物量的影響并不明顯，但適量添加時(shí)還是會(huì)有一定的促進(jìn)作用。

圖2 單一微量元素對(duì)生物量的影響Fig.2 Effect of single trace element on biomass

2.2 微量元素缺失對(duì)發(fā)酵的影響

2.2.1 微量元素缺失對(duì)產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率、生物量的影響

綜合2.1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NiCl2·6H2O、PLP、維生素B2、維生素H最適添加量分別為1.1×10-2、4.7×10-4、6×10-3、6×10-4、3×10-2、1.5×10-2、6.06×10-3、1×10-2、6×10-3、1×10-3g/L，在均添加最適濃度的前提下，以實(shí)驗(yàn)涉及的10種微量元素全部添加為對(duì)照組，探究微量元素單一缺失對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果取3組平行實(shí)驗(yàn)平均值，如圖3所示。

圖3 微量元素缺失對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of lack of trace elements on fermentation 注：橫坐標(biāo)代表缺失對(duì)應(yīng)的微量元素的實(shí)驗(yàn)組

如圖3所示，從生物量差異來(lái)看，F(xiàn)eSO4·7H2O、維生素H的缺失對(duì)生物量影響最大，較對(duì)照組分別降低了10.0%、10.6%，剩余8種微量元素對(duì)生物量影響并不顯著，因此可以看出FeSO4·7H2O、維生素H在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的必要性，且不能通過(guò)添加其他微量元素彌補(bǔ)；從L-Phe產(chǎn)量來(lái)看，MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O的缺失對(duì)產(chǎn)量的影響最為顯著，分別較對(duì)照組降低了15.0%、10.1%，其次是CoCl2·6H2O、PLP，當(dāng)兩者缺失時(shí)產(chǎn)量較對(duì)照組分別降低了7.0%、8.5%，Mn2+、Fe2+和Co2+離子作為NADH酶的酶激活劑[21-22]，能夠很大程度上提高L-Phe的產(chǎn)量，即使報(bào)道[21]稱Mn2+能夠優(yōu)先與NADH酶結(jié)合，但本實(shí)驗(yàn)證明了Mn2+、Fe2+、Co2+的單獨(dú)缺失均會(huì)影響L-Phe的產(chǎn)量。PLP的缺失也影響到了最終產(chǎn)量，推測(cè)該物質(zhì)可作為其他關(guān)鍵酶的輔酶，進(jìn)而影響L-Phe的產(chǎn)量。其他微量元素的缺失并未造成明顯的產(chǎn)量下降，其中CuSO4·5H2O的缺失反而使得產(chǎn)量較對(duì)照組提高了2.1%；從糖酸轉(zhuǎn)化率來(lái)看，CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、維生素B2的缺失分別使得糖酸轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組下降了2.8%、4.6%、3.5%、6.3%、2.8%，CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP對(duì)轉(zhuǎn)化率造成的影響與產(chǎn)量的變化趨勢(shì)相同，因此認(rèn)為轉(zhuǎn)化率下降是由于產(chǎn)量下降引起，維生素B2是生物體內(nèi)一些氧化還原酶的輔基，對(duì)電子傳遞、脫氫等反應(yīng)具有催化作用，可以認(rèn)為維生素B2促進(jìn)了菌體的能量代謝，進(jìn)而提高了糖酸轉(zhuǎn)化率，但其具體作用機(jī)制還待研究。維生素H的缺失很大程度上提高了糖酸轉(zhuǎn)換率，較對(duì)照組提高了8.5%，對(duì)應(yīng)菌體量下降明顯，即使在2.1的結(jié)果中證明了維生素H單一存在可以一定程度的提升L-Phe的產(chǎn)量，但這種提升完全能夠被其他微量元素替代，因此外源添加維生素H并不適合大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe。

2.2.2 微量元素缺失對(duì)酶活力的影響

L-Phe合成途徑中的限速酶為DAHP、CM、PDT[4]，最終生成的苯丙酮酸在芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成L-Phe，因此將上述4種酶統(tǒng)稱為關(guān)鍵酶。

根據(jù)2.1中的結(jié)果得知，實(shí)驗(yàn)涉及的10種微量元素對(duì)提高L-Phe產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋篗nSO4·H2O>FeSO4·7H2O>CoCl2·6H2O>PLP>維生素B2>維生素H>>NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4(后4位不分先后，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于前6位)；對(duì)提高L-Phe糖酸轉(zhuǎn)化率的影響順序?yàn)椋篜LP>FeSO4·7H2O>MnSO4·H2O>維生素B2、CoCl2·6H2O>>維生素H、NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4(后5位不分先后，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于前5位)，因此默認(rèn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小的NiCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4以通過(guò)單因素試驗(yàn)得到了最佳添加量，并猜測(cè)CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、維生素B2為L(zhǎng)-phe合成途徑中關(guān)鍵酶的輔酶或輔因子，因此本部分實(shí)驗(yàn)以5種物質(zhì)均添加最適用量作為對(duì)照組，單一缺失任意一種為實(shí)驗(yàn)組，取樣檢測(cè)4種關(guān)鍵酶的酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 微量元素缺失對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of lack of trace elements on enzyme activity

如圖4所示，對(duì)照組DAHP酶活力為4 347.3 μmoL/(h·g)，F(xiàn)eSO4·7H2O的缺失使得酶活力較對(duì)照組下降了21.5%，MnSO4·H2O的缺失使得酶活力下降了23.4%，證明了FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O的不可缺少性，其余微量元素的缺失并未引起酶活力的明顯下降；對(duì)照組CM酶活力為3 292.5 μmoL/(h·g)，F(xiàn)eSO4·7H2O的缺失使得酶活力較對(duì)照組下降了35.2%，其余微量元素并未引起酶活力的明顯下降，因此可以認(rèn)為CM是Fe2+依賴性的；對(duì)照組PDT酶活力為3 321.4 μmoL/(h.g)，F(xiàn)eSO4·7H2O的缺失使得酶活力下降了33.6%，這與CM情況類似，因此認(rèn)為Fe2+對(duì)CM-PDT是至關(guān)重要的輔因子；對(duì)照組芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活力為3 813.8 μmoL/(h·g)，PLP的缺失使得酶活力下降了39.3%，因此認(rèn)為PLP是芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶至關(guān)重要的輔因子。維生素B2的缺失使得每個(gè)酶相對(duì)對(duì)照組均出現(xiàn)了一定程度的下降，但未引起某個(gè)具體的關(guān)鍵酶活力的明顯下降，認(rèn)為維生素B2作為氧化脫氫類酶的輔酶，并不能直接影響到芳香族氨基酸的生成，但能在EMP、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，HMP)等途徑中加快能量代謝，從而間接提高L-Phe的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率。CoCl2·6H2O的缺失使得DAHP、CM活力輕微下降，并未影響到其他3種酶的活力，但結(jié)合2.2.1中結(jié)論，CoCl2·6H2O的缺失使得產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率均下降明顯，推測(cè)該物質(zhì)可作為莽草酸途徑相關(guān)酶的輔因子，從而影響到L-Phe的生成。

2.3 正交分析探究關(guān)鍵微量元素的最適用量

2.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP、維生素B2為L(zhǎng)-Phe發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵因素，因此本研究繼續(xù)對(duì)這5種物質(zhì)的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表3所示。

表3 L-Phe產(chǎn)量正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment on L-Phe yield

如表3所示，從產(chǎn)量均值來(lái)看，因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、PLP、維生素B2的最適添加量分別為28×10-3、14.0×10-3、5.5×10-3、10×10-3、6.5×10-3g/L，由產(chǎn)量極差可知因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O為影響L-Phe產(chǎn)量的主要因素，其中MnSO4·H2O為關(guān)鍵因素。因素CoCl2·6H2O、PLP、維生素B2極差均較小，對(duì)產(chǎn)量的影響并不顯著，為次要因素；由轉(zhuǎn)化率均值可知，因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、PLP、維生素B2的最適添加量分別為2.8×10-2、1.45×10-2、5.5×10-3、1×10-3、5.5×10-3g/L。由轉(zhuǎn)化率極差可知因素FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP為影響糖酸轉(zhuǎn)化率的主要因素，其中FeSO4·7H2O為關(guān)鍵因素。因素CoCl2·6H2O、維生素B2極差較小，對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響并不顯著，為次要因素。

綜合來(lái)看，F(xiàn)eSO4·7H2O、MnSO4·H2O、PLP用量的進(jìn)一步優(yōu)化對(duì)產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率有較大影響，因素FeSO4·7H2O在2.8×10-2g/L時(shí)兩項(xiàng)均值均為最大，因素MnSO4·H2O取1.4×10-2g/L時(shí)產(chǎn)量均值最大，取1.45×10-2g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率均值最大，因此可有選擇性的選擇MnSO4·H2O的添加量，PLP取1×10-2g/L時(shí)產(chǎn)量均值最大，取9.5×10-3g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率均值最大，但PLP對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響遠(yuǎn)大于對(duì)產(chǎn)量的影響，因此選取9.5×10-3g/L為最適添加量。CoCl2·6H2O、維生素B2的濃度變化在本部分實(shí)驗(yàn)中并未明顯影響到轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量，因此可以認(rèn)為二者已達(dá)最適用量，再次優(yōu)化并無(wú)意義。

2.4 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證

前期實(shí)驗(yàn)確定了維生素H對(duì)L-Phe發(fā)酵的不利影響，得知了其余9種微量元素的最適添加量，但由于搖瓶發(fā)酵具有較大的局限性，因此在之前實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以CaCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NiCl2·6H2O、PLP、維生素B2分別添加1.1×10-2、4.7×10-4、6×10-3、6×10-4、2.8×10-2、1.4×10-2、6.06×10-3、1×10-2、6×10-3g/L為實(shí)驗(yàn)組，以不添加微量元素作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，使用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)前期微量元素用量?jī)?yōu)化結(jié)果。

2.4.1 微量元素對(duì)生物量與耗糖速率的影響

由圖5可知，實(shí)驗(yàn)組生物量與耗糖速率在發(fā)酵過(guò)程中始終高于對(duì)照組，最大生物量122.8遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組最大生物量101.3，達(dá)到最大耗糖速率的時(shí)間比對(duì)照組提前了4 h，但在數(shù)值上相近；在發(fā)酵進(jìn)行到34 h時(shí)，對(duì)照組生物量開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，耗糖速率也呈現(xiàn)大幅度的下滑，此時(shí)實(shí)驗(yàn)組生物量與耗糖速率均處于穩(wěn)定期；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到40 h，對(duì)照組幾乎無(wú)法繼續(xù)攝糖，生物量持續(xù)下降，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，此時(shí)實(shí)驗(yàn)組生物量依據(jù)處于穩(wěn)定期，但耗糖速率有所下降；發(fā)酵50 h，實(shí)驗(yàn)組生物量依舊沒有明顯的下降趨勢(shì)，但此時(shí)耗糖速率下降嚴(yán)重，因此結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵周期較對(duì)照組延長(zhǎng)了10 h。

圖5 耗糖速率與生物量過(guò)程變化Fig.5 Variation of sugar consumption rate and biomass in fermentation process

2.4.2 微量元素對(duì)L-Phe產(chǎn)量及實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響

實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)換率是指發(fā)酵進(jìn)行到某一時(shí)刻時(shí)，在該時(shí)刻生產(chǎn)的總酸與總糖之比，該數(shù)據(jù)可體現(xiàn)出發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)時(shí)間段的產(chǎn)酸效率，因此設(shè)法延長(zhǎng)高效率時(shí)期或者提高最大實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化率均有利于L-Phe的發(fā)酵生產(chǎn)。

由圖6可知，當(dāng)微量元素缺失時(shí)，L-Phe產(chǎn)量總體偏低，且增加趨勢(shì)平穩(wěn)，最終產(chǎn)量為56.4 g/L，這與轉(zhuǎn)化率曲線趨勢(shì)大致相同，整體呈上升趨勢(shì)，在22～26 h出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)長(zhǎng)-Phe在臨近結(jié)晶濃度時(shí)會(huì)形成松軟的假晶體狀態(tài)[23]，同時(shí)伴隨大量的發(fā)酵泡沫，此時(shí)難以繼續(xù)生成L-Phe，但菌體持續(xù)耗糖，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降；實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量在經(jīng)歷了0～20 h的緩慢積累后，在20～35 h達(dá)到了產(chǎn)酸的高峰期，之后增長(zhǎng)速度減緩，但總量依舊在增長(zhǎng)，最終產(chǎn)量為85.4 g/L，較對(duì)照組增加了51.4%。實(shí)驗(yàn)組實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化率曲線波動(dòng)程度較對(duì)照組較大，在0～6 h急劇上升，由于種子液培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，因此在接發(fā)酵后菌體立即開始產(chǎn)酸，且此時(shí)菌體擴(kuò)增速度較緩慢，轉(zhuǎn)換率急劇上升，在6 h后，生物量開始迅速增加，雖然產(chǎn)酸也在增加，但大部分葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)，因此糖酸轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在24 h前后，產(chǎn)量接近結(jié)晶濃度，與對(duì)照組相同，此時(shí)轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步下降，當(dāng)L-Phe結(jié)晶后，菌體進(jìn)入產(chǎn)酸高峰期，此時(shí)轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量均迅速增加，直至發(fā)酵后期(40 h后)產(chǎn)酸速率再次減緩，但耗糖速率下降并不明顯，轉(zhuǎn)化率再次降低，最終轉(zhuǎn)化率為26.3%，遠(yuǎn)大于對(duì)照組的21.4%，即使實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率曲線波動(dòng)較大，但在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化率均高于對(duì)照組，因此實(shí)驗(yàn)組更具優(yōu)勢(shì)。

圖6 實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量過(guò)程變化Fig.6 Variation of real-time conversion rate and yield in fermentation process

2.4.3 微量元素對(duì)副產(chǎn)物的影響

取發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液進(jìn)行副產(chǎn)物含量檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。

實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了0.8 g/L的乙酸、1.2 g/L的谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)與0.2 g/L的L-Trp，均不會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝以及后續(xù)提取造成影響。對(duì)照組乙酸含量為6.7 g/L，此時(shí)的乙酸含量可嚴(yán)重影響菌體的生長(zhǎng)代謝，是對(duì)照組發(fā)酵后期生物量迅速下降的主要原因；L-Glus與L-Trp含量達(dá)到了3.3、1.4 g/L，分別比對(duì)照組增加了175%、600%，既影響轉(zhuǎn)化率，又提高了后續(xù)分離提取難度；對(duì)照組發(fā)酵液中檢測(cè)出來(lái)了L-Ala(1.8 g/L)，這在實(shí)驗(yàn)組并未檢出，推測(cè)是由于莽草酸途徑關(guān)鍵酶活力不夠，導(dǎo)致糖酵解途徑大量積累丙酮酸，而丙酮酸作為L(zhǎng)-Ala的直接前體，經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)即可生成L-Ala，通常來(lái)講L-Ala只作為氨基酸代謝的中間體，難以積累[24]，但對(duì)照組在發(fā)酵后期衰亡嚴(yán)重，菌體幾乎無(wú)法進(jìn)行代謝反應(yīng)，使得L-Ala能夠少量積累。

圖7 副產(chǎn)物產(chǎn)量對(duì)比Fig.7 Comparison of by-product yield

3 結(jié)論

金屬離子、維生素等微量元素可在微生物眾多代謝途徑中起到關(guān)鍵作用，如作為關(guān)鍵酶的輔酶、輔因子，或者作為反應(yīng)前體物質(zhì)的載體等，L-Phe作為莽草酸途徑的主要代謝產(chǎn)物，其合成路徑長(zhǎng)、副產(chǎn)物多，涉及的酶促反應(yīng)較多，因此對(duì)微量元素的種類及用量要求較高，本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以關(guān)鍵酶活力、L-Phe產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物含量等為指標(biāo)，對(duì)L-Phe發(fā)酵涉及的微量元素種類及用量進(jìn)行優(yōu)化了，最終確定的種類為及用量分別為：CaCl2·2H2O 1.1×10-2g/L、CuSO4·5H2O 4.7×10-4g/L、CoCl2·6H2O 6×10-3g/L、ZnSO46 ×10-4g/L、FeSO4·7H2O 2.8×10-2g/L、MnSO4·H2O 1.4×10-2g/L、NiCl2·6H2O 6.06×10-3g/L、PLP 9.5×10-3g/L、維生素B26×10-3g/L。以不添加微量元素為對(duì)照組，優(yōu)化后產(chǎn)酸期明顯延長(zhǎng)，DAHP、CM、PDT、芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的酶活力顯著提高，生物量(OD600)達(dá)到了122.8，較對(duì)照組提高了17.5%，L-Phe產(chǎn)量達(dá)到了85.4 g/L，較對(duì)照組提高了51.4%，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了26.3%，較對(duì)照組提高了18.6%，副產(chǎn)物種類與含量均遠(yuǎn)低于對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)確定了維生素B2對(duì)L-Phe發(fā)酵的促進(jìn)作用與生物素(維生素H)的負(fù)面影響，針對(duì)性優(yōu)化了CoCl2·6H2O、PLP的用量，進(jìn)一步優(yōu)化了FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O等微量元素的用量。最終L-Phe產(chǎn)量較文獻(xiàn)[4]最高記載提高了4.5%，這對(duì)L-Phe的工業(yè)化生產(chǎn)具有積極意義。