潘 林,曹 瑞,焦德志

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，161006，黑龍江齊齊哈爾)

隨著世界經(jīng)濟(jì)的不斷增長(zhǎng)，石油的需求日益增加；然而，在石油生產(chǎn)和運(yùn)輸過(guò)程中因意外導(dǎo)致的石油泄露會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞[1]，并通過(guò)污染地下水系等間接方式危及人類健康[2]。石油中黏度較大的烴類化合物進(jìn)入土壤后可導(dǎo)致土壤板結(jié)，并且石油中的大量疏水性化合物阻礙植物對(duì)水的吸收，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，破壞植物根部固土作用，最終導(dǎo)致水土流失。石油可以增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤碳氮元素的比值，然而石油中的碳元素與土壤原本的碳和植物光合作用所需要碳不同，因此雖然石油可以給土壤提供大量的碳元素，但依舊會(huì)造成土壤營(yíng)養(yǎng)失調(diào)[3]。有學(xué)者在比較石油污染土壤理化性質(zhì)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，石油污染能增加土壤中有機(jī)碳含量、pH、碳氮和碳磷比值，而總氮含量與電導(dǎo)率無(wú)顯著變化[4]。石油污染能促進(jìn)土壤中具有降解石油烴能力的真菌、細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)，提高其在土壤中的豐度和多樣性[5]。石油污染也會(huì)對(duì)土壤微生物的活性和數(shù)量有一定抑制作用，降低植物叢植菌根真菌的產(chǎn)孢能力[6]。這主要與石油污染物的組成和土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)[7]。石油污染會(huì)改變土壤營(yíng)養(yǎng)成分的組成，會(huì)導(dǎo)致與硝化作用有關(guān)和厭氧類微生物數(shù)量降低，使有氧硝化細(xì)菌豐度升高。石油污染也會(huì)對(duì)固氮細(xì)菌和放線菌產(chǎn)生較大的影響[8-9]。

蘆葦是濕地的重要植被，具有很強(qiáng)的抗逆性，并且是防治水土流失，用于濕地修復(fù)的主要植物材料。蘆葦在適應(yīng)高度異質(zhì)性生境的過(guò)程中，其形態(tài)、生理、生活史策略等會(huì)發(fā)生改變，形成不同的生態(tài)型[10]。植物根際微生物可以通過(guò)固氮、解磷、降解土壤有害物質(zhì)、抑制土壤中病原菌等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)，幫助植物抵抗毒害物質(zhì)脅迫[11]。蘆葦根系可以改善根際土壤物理性質(zhì)和孔隙度，增加土壤滲透性和水源涵養(yǎng)能力[12]。

筆者以扎龍濕地蘆葦及其原位土壤為材料，采用盆栽方式人工模擬石油污染，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析和比較蘆葦根際土壤中微生物的群落組成，揭示蘆葦根際微生物群落結(jié)構(gòu)的以及對(duì)石油污染的響應(yīng)，有助于完善石油污染下蘆葦-根際微生物-土壤三者的之間相互作用的生態(tài)學(xué)理論，并為蘆葦在石油污染土壤中維持根系固土能力和恢復(fù)水土調(diào)控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

蘆葦根莖和土壤于采自扎龍濕地(E 124°9′1″、N 47°17′18″)，樣地年均氣溫3.2 ℃，年日照時(shí)間2 700～3 000 h，平均地溫4.9 ℃。石油來(lái)自大慶油田。

2 材料與方法

2.1 模擬石油污染

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理組，石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為T(mén)1(3 g/kg)、T2(6 g/kg)、T3(12 g/kg)，對(duì)照組CK(0 g/kg)，按照土壤質(zhì)量(15 kg)稱取石油于燒杯中，加入適量石油醚，使石油完全溶解后，混勻后置于塑料花盆中，加入1 L水，靜置24 h，每盆橫向定植5條新鮮蘆葦根莖。培養(yǎng)60 d后，采用抖根法收集蘆葦根際土壤，一部分4 ℃保存，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定，另一部分-20 ℃保存，用于高通量測(cè)序。

2.2 蘆葦根際土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

將采集的土壤風(fēng)干后，研磨，過(guò)2 mm篩，土壤pH值、銨態(tài)氮、有效鉀和速效磷含量采用土壤養(yǎng)分分析儀(比色法)測(cè)定，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)利用重鉻酸鉀稀釋熱法測(cè)定[13]。

2.3 蘆葦根際微生物DNA的提取和高通量測(cè)序

Illumina Miseq高通量測(cè)序由生工生物工程(上海)公司完成，主要步驟為根據(jù)E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒操作步驟提取土壤中微生物總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG；805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA；擴(kuò)增條件見(jiàn)圖1),經(jīng)純化回收以及定量混合后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

圖1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Fig.1 Conditions for PCR amplification

使用FLASH(版本1.2.3)和Prinseq(版本0.20.4)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)量控制后，使用R(版本3.2)和MEGAN(版本5.7.1)軟件進(jìn)行分析。對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)為RDP classifier(16s fungal 28s),Silva(16s,18s),Unite。

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤pH是土壤鹽堿化程度的重要指標(biāo)之一，土壤中有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、有效鉀，速效磷等含量與土壤肥力有著密切關(guān)系。3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油處理60 d后，土壤理化性質(zhì)如表1所示，可知，各處理組(T1-T3)土壤的pH和有效鉀含量與對(duì)照組(CK)間差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，各處理組的銨態(tài)氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的均值分別顯著(P<0.05)高于對(duì)照組，分別提高41%、121%和141%。因此，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的石油污染對(duì)土壤的pH和有效鉀含量影響不大，但顯著提高銨態(tài)氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 石油污染后土壤的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of soil after petroleum pollution

3.2 OTU聚類分析

在97%的相似水平下，統(tǒng)計(jì)不同石油處理下蘆葦根際土壤中操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)數(shù)量，由圖2可知，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(CK、T1、T2和T3)的蘆葦根際土壤樣本中分別檢測(cè)到3 482、2 844、3 311和3 336個(gè)OTU，其中共有的OTU為1 200個(gè)，特有的OTU分別為556、412、446和569，分別占CK、T1、T2、T3蘆葦根系土壤樣本總OTU的15.96%、14.48%、13.47%、17.05%。

圖2 不同石油處理后根際細(xì)菌OTU韋恩圖Fig.2 OTU Venn profile of rhizosphere bacteria after different treatments of petroleum

3.3 對(duì)蘆葦根際細(xì)菌Alpha多樣性的影響

通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序分析蘆葦根際細(xì)菌alpha多樣性，結(jié)果如表2所示，分別獲得37 688～51 552條序列，OTU數(shù)為2 844～3 482個(gè)。Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，Shannon指數(shù)是用來(lái)估算樣本中微生物多樣性，Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。結(jié)果顯示T1處理的蘆葦根際土壤中Chao1和Shannon指數(shù)最低，說(shuō)明T1處理蘆葦根際土壤中細(xì)菌總數(shù)最少，細(xì)菌多樣性最低，T3處理的細(xì)菌數(shù)和多樣性為最高。

表2 不同石油處理根際細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Comparisons of α-diversity of rhizosphere bacteria after different treatments of petroleum

3.4 對(duì)蘆葦根際細(xì)菌群結(jié)構(gòu)的影響

蘆葦根際土壤測(cè)序共獲得33個(gè)門(mén)，不同石油處理蘆葦根際土壤門(mén)分類水平下菌群組成和豐度情況如圖3所示。Proteobacteria是蘆葦根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在CK、T1、T2、T3中的相對(duì)豐度分別為37.31%、45.97%、46.6%、46.26%。其次為Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Planctomycetes、Verrucomicrobia在各處理組中這些門(mén)的細(xì)菌數(shù)合計(jì)占各處理組比例分別為50.53%、44.59%、39.5%、45.68%。

圖3 不同石油處理后根際土壤細(xì)菌門(mén)分類豐度統(tǒng)計(jì)Fig.3 Abundance statistics of bacterial phylum classification in rhizosphere soil after different treatments of petroleum

由圖4可知，在屬水平上，根際土壤中測(cè)得111屬細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌(相對(duì)豐度大于1%)有23種。優(yōu)勢(shì)菌中有些隨著石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加相對(duì)豐度上升，例如：Pseudomonas(1.87%～6.34%)、Hydrogenophaga(0.11%～4.49%)、Nitriliruptor(0.58%～1.66%)；有些細(xì)菌相對(duì)豐度隨石油含量的升高而下降：Exiguobacterium(3.33%～1.88%)、Rhodoligotrophos(2.44%～1.09%)、Citrobacter(2.05%～0.93%)、Aridibacter(1.63%～0.72%)、Azoarcus(2.59%～0.61%)、Gp21(1.62%～0.23%)、Mongoliicoccus(1.48%～0.15%)；Desulfuromonas、Bellilinea相對(duì)豐度隨著石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈先上升后下降；Gp6，Gp16相對(duì)豐度無(wú)顯著變化。

圖4 不同石油處理后根際微生物群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度Fig.4 Community structures and relative abundances of rhizosphere bacteria after different treatments of petroleum

3.5 對(duì)蘆葦根際細(xì)菌群落Beta多樣性的影響

通過(guò)主成分分析(PCA)比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油污染下蘆葦根際微生物群落Beta多樣性，結(jié)果如圖5所示。其中主成分1(PCA1)可解釋變量為68%，主成分2(PCA2)可解釋變量為11%,可見(jiàn)T1、T2、T3相互距離較近，能夠聚集，CK與其他3組距離較遠(yuǎn)，并且隨著加入石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，各處理組距離CK越來(lái)越遠(yuǎn)。說(shuō)明石油是改變各樣本菌群Beta多樣性主要因素，石油處理后的各樣本菌群落多樣性之前表現(xiàn)出相似性，而無(wú)石油處理的對(duì)照組與處理組存在明顯差異。

圖5 不同石油處理后根際細(xì)菌群落組成PCA分析Fig.5 PCA analysis of the microbial community in the rhizosphere after different treatments of petroleum

4 討論

4.1 對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)是植物和微生物生存的重要影響因子。土壤的酸堿性對(duì)土壤肥力、植物和微生物生長(zhǎng)有顯著影響，若土壤pH過(guò)低或過(guò)高，均會(huì)導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)性變差，使土壤黏重、板結(jié)、水、氣熱不協(xié)調(diào)，不利于耕作和植物生長(zhǎng)[13]。石油污染會(huì)影響土壤理化性質(zhì)，在研究安塞縣8個(gè)類型油井周圍土壤石油污染理化性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，石油污染會(huì)導(dǎo)致pH值、速效磷、速效鉀含量顯著降低，有機(jī)質(zhì)和銨態(tài)氮含量顯著升高[14]。也有學(xué)者人研究發(fā)現(xiàn)，石油污染使土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，pH降低，而對(duì)速效磷，銨態(tài)氮，速效鉀無(wú)顯著影響[15]。石油污染引起土壤pH值變化的主要原因與微生物降解石油烴的酸性中間產(chǎn)物有關(guān)[16]。本研究土壤屬于堿性較強(qiáng)土壤，經(jīng)過(guò)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油污染后，pH值未發(fā)生顯著差異。這可能是分解石油的微生物受到土壤堿性的影響，使分解石油烴的速率低，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)較少，而土壤具有一定的緩沖作用，蘆葦根系也具有富集和吸收污染物的能力，因此使得土壤pH未能有顯著變化。不同產(chǎn)地的石油組分存在差異，低硫高氮是中國(guó)油田所產(chǎn)石油的主要特點(diǎn)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示銨態(tài)氮和速效磷含量在石油處理后顯著升高，但在不同石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理下無(wú)顯著差異，有效鉀含量不隨石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而發(fā)生改變。這可能與實(shí)驗(yàn)所用石油組分中富含氮、磷元素，而鉀元素含量較少有關(guān)。氮、磷元素是制約石油生物降解速率的關(guān)鍵因子之一，微生物通過(guò)消耗土壤中的氮、磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提高石油的降解效率，導(dǎo)致銨態(tài)氮和有效磷含量在不同石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理下無(wú)顯著變化[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示土壤中有機(jī)質(zhì)含量隨著石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高，這是由于石油中含有大量烴類物質(zhì)，當(dāng)石油進(jìn)入土壤后，烴類物質(zhì)作為碳源，增加了土壤中有機(jī)質(zhì)的含量。

4.2 對(duì)蘆葦根際土壤中細(xì)菌多樣性的影響

細(xì)菌是土壤中重要組成部分，細(xì)菌的生長(zhǎng)情況是評(píng)價(jià)土壤健康狀態(tài)和生態(tài)學(xué)的重要指標(biāo)。Illumina Miseq高通量測(cè)序可以更深層次地了解土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及豐度。因此，常應(yīng)用于分析土壤樣品中微生物群落的多樣性。結(jié)果顯示，不同程度石油處理土壤中OTU豐度和細(xì)菌多樣性隨著石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先下降后上升趨勢(shì)。石油進(jìn)入土壤后，為土壤提供豐富的碳源，增加了細(xì)菌的代謝底物，但是有些高分子石油烴對(duì)細(xì)菌也有一定危害作用，使細(xì)菌群落發(fā)生改變。因此，輕度石油污染的毒性導(dǎo)致非石油耐受細(xì)菌群落豐度下降，并且無(wú)法為石油耐受菌生長(zhǎng)提供足夠的碳源，導(dǎo)致總體細(xì)菌群落豐度降低。隨著石油污染程度的增加，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的石油彌補(bǔ)了石油耐受菌生長(zhǎng)碳源的不足，促進(jìn)了石油耐受菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)菌豐度逐漸升高。這與初金美等人研究結(jié)果相似[20]。

4.3 對(duì)蘆葦根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

不同種類的細(xì)菌對(duì)石油污染的耐受能力存在差異，因此分析土壤中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)能更加深入了解石油污染對(duì)蘆葦根際土壤細(xì)菌演化過(guò)程和耐受石油的優(yōu)勢(shì)菌屬。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，石油污染改變了蘆葦根際土壤中細(xì)菌群落的組成。Proteobacteria在土壤中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)并且隨著石油污染程度的升高，其相對(duì)豐度增加。這不僅與Proteobacteri作為細(xì)菌中最大的一門(mén)有關(guān)，還因?yàn)镻roteobacteri中Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria具有潛在的降解石油作用，而且Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria面對(duì)石油污染時(shí)會(huì)表現(xiàn)處很強(qiáng)的“阻抗”和“回彈能力”[21]，更能適應(yīng)石油污染并且利用石油烴進(jìn)行代謝和繁殖。在屬水平上，蘆葦根際土壤細(xì)菌主要由23種優(yōu)勢(shì)菌控制，其相對(duì)比例隨著石油污染程度而發(fā)生改變。Pseudomonas和Hydrogenophaga是高效降解石油烴能力的菌屬，已被人們?cè)谑臀廴緟^(qū)域或自然環(huán)境中被分離出來(lái)[21-23]。在本文結(jié)果中，Pseudomonas和Hydrogenophaga相對(duì)比例隨著石油污染的加劇而升高，說(shuō)明該這2種細(xì)菌能在自身免于石油毒害的同時(shí)還能以石油中有機(jī)物為代謝底物，進(jìn)行大量繁殖。另外還有研究表明Pseudomonas具有明顯的植物根際效應(yīng)，在植物根際區(qū)域能顯著提高該細(xì)菌活性和數(shù)量[24]。Exiguobacterium、Rhodoligotrophos、Citrobacter、Aridibacter、Azoarcus、Gp21、Mongoliicoccus的相對(duì)豐度與石油含量呈負(fù)相關(guān)，石油污染影響其生長(zhǎng)和繁殖。Desulfuromonas和Bellilinea相對(duì)豐度在石油含量較低時(shí)升高，但是當(dāng)石油含量升高時(shí)下降。導(dǎo)致其下降的原因可能與其對(duì)石油敏感性有關(guān)。

5 結(jié)論

1)石油污染可以改變土壤中部分理化性質(zhì)，使土壤中銨態(tài)氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)含量顯著升高，最高分別上升了41%、121%和141%，而pH值，有效鉀含量無(wú)顯著變化。

2)石油污染對(duì)蘆葦根際土壤細(xì)菌多樣性有影響。α多樣性分析顯示，隨著石油污染程度的增加，蘆葦根際細(xì)菌豐度和多樣性指數(shù)逐漸升高。β多樣性分析顯示無(wú)石油添加的對(duì)照組與石油處理組具有差異。

3)石油污染改變蘆葦根際土壤細(xì)菌群落組成，而不同的類型的細(xì)菌對(duì)石油的敏感程度不同。石油污染促進(jìn)了Pseudomonas和Hydrogenophaga的生長(zhǎng)，抑制Exiguobacterium、Rhodoligotrophos、Citrobacter、Aridibacter、Azoarcus、Gp21、Mongoliicoccus的生長(zhǎng)。輕度石油污染會(huì)對(duì)Desulfuromonas和Bellilinea的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，重度石油污染抑制其生長(zhǎng)。