梁宗英，楊 陽，孫光蕊，趙寶山，辛國華，張 樂，侯繼申

1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科，河北 承德 067000；2.河北省胸科醫(yī)院臨床實驗室，河北 石家莊 050000

食管癌是全世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居高不下［1］。雖然手術及放化療在一定程度上改善了部分食管癌患者的預后，但其總體生存率仍不容樂觀［2］。因此，研究食管癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子機制，就成為預防和治療食管癌新的理論突破口。

ATP結合盒轉運子E1（ATP-combined box transporter E1，ABCE1）的基因是一種癌基因，其編碼的ABCE1蛋白在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)，且其與腫瘤的增殖、轉移及預后密切相關［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，ABCE1在食管癌組織中呈高表達，且其與食管癌的增殖、凋亡、侵襲和轉移密切相關。

蛋白質乙?；揎検潜碛^遺傳學修飾中的重要組成部分，參與多種生物學過程。蛋白質的乙?；揎椥枰谝阴；D移酶的催化下進行，故在蛋白質乙?；揎椀纳飳W過程中，乙?；D移酶也扮演了重要的角色，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。 食管癌中乙酰基轉移酶3b（acetyltransferase 3b，KAT3b）是乙酰基轉移酶家族中的重要一員，可以催化多種組蛋白及非組蛋白發(fā)生乙?；M而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究通過檢測食管癌中ABCE1和KAT3b的表達及ABCE1蛋白的乙?；?，分析KAT3b、ABCE1乙?；c病理學特征之間的相關性，并觀察下調KAT3b對ABCE1蛋白乙?；降挠绊懀接懸阴；D移酶KAT3b與ABCE1蛋白乙酰化修飾之間的內在聯(lián)系、在食管癌發(fā)病過程中的作用及其機制。

1 資料和方法

1.1 組織和細胞

選取2020年1月—2021年5月承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科手術切除的食管癌標本。納入標準：術后腫瘤組織病理學檢查證實為鱗癌，無其他腫瘤病史，術前無放化療、免疫及靶向治療史；實驗組：55例食管癌組織；對照組：55例相同患者與之對應正常食管黏膜組織。一般資料：男性44例，女性11例；≥60歲42例，＜60歲13例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期32例，Ⅲ期16例；組織分化：高分化7例，中分化40例，低分化8例；有淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移41例。本研究經(jīng)承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。人食管癌細胞系EC109由承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 主要試劑

ABCE1單克隆抗體、Acetylated-Lysine抗體、KAT3b抗體均購自英國Abcam公司，A/G瓊脂糖珠購自美國CST公司，DNA提取試劑盒購自北京全式金生物有限公司，免疫組織化學SP試劑盒和濃縮型DAB試劑均購自珠海市泉暉企業(yè)有限公司，Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔熒光抗體、ATTO 594-conjugated羊抗鼠熒光抗體購自河北貝博實驗用品有限公司。RNA引物由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學SP法

組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡，滴加3%H2O2，室溫放置10 min。破膜后，放入檸檬酸緩沖液，高溫修復抗原。切片冷卻，加山羊血清，室溫封閉。清洗后，濕盒中加入一抗（KAT3b單克隆抗體1∶1 000；ABCE1單克隆抗體，1∶1 000）4℃溫育過夜。室溫條件下，二抗溫育30 min。DBA顯色，蘇木精復染。

1.3.2 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

提取蛋白，蛋白濃度測定；采用凝膠電泳分離總蛋白，并采用半干轉膜法將總蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將膜放入稀釋好的一抗（KAT3b單克隆抗體1∶1 000；ABCE1單克隆抗體，1∶1 000）溫育40 min。漂洗后，將膜放入稀釋好的二抗中溫育30 min。漂洗后，暗室中進行發(fā)光反應，并曝光成片。采用Image pro plus軟件分析蛋白條帶的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以目的蛋白IOD值和內參IOD值的比值反映各組目的蛋白的表達量。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

提取組織和細胞總RNA，取300 ng RNA，按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。應用熒光定量試劑盒檢測ABCE1和KAT3b mRNA的相對表達量。相對表達量為2-ΔΔCt。

1.3.4 生物信息學分析和預測

生物信息學軟件乙?；患ㄜ浖ˋcetylation Set Enrichment Based，ASEB）預測可以將ABCE1蛋白作為底物催化其發(fā)生乙?；囊阴；D移酶［6］。ASEB不僅可以預測目的蛋白乙?；癄顟B(tài)，還可以預測催化目的蛋白發(fā)生乙?；揎椀囊阴；D移酶及可能發(fā)生乙?；馁嚢彼嵛稽c。

1.3.5 熒光免疫組織化學（fluorescence immunohistochemistry，IF）法

組織切片60 ℃恒溫箱中烘烤20 min，二甲苯及乙醇脫蠟，磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphatebuffered saline，PBS）清洗后抗原修復；5%山羊血清室溫封閉30 min，甩去多余液體；加一抗（ABCE1抗體1∶1 000，KAT3b抗體1∶1 000），4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min，PBS洗3次；加熒光標記的二抗（羊抗兔熒光抗體1∶200、羊抗鼠熒光抗體1∶200），室溫避光溫育1 h，PBS洗3次；DAPI染色10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅封片劑封片，拍照。

1.3.6 免疫共沉淀

組織提取蛋白質，加入A/G瓊脂糖珠5 mL和ABCE1單克隆純抗體5 μL，混勻后補充2×裂解緩沖液至每管總體積450 μL，取上清液400 μL置入離心管，4 ℃、15 r/min，固定混勻器共沉淀12 h。4 ℃離心，棄上清液。1×裂解緩沖液500 μL洗滌A/G瓊脂糖珠。4 ℃，3 000 r/min，離心3 min，棄上清液。最后一次洗滌完畢后，棄去上清液。1×裂解緩沖液35 μL和等體積的2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）上樣緩沖液混合，煮沸8 min；3 000 r/min，離心；行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、電轉移、封閉，加入一抗（acetylated-lysine抗體1∶2 000，KAT3b抗體 1∶1 000，GAPGH抗體1∶1 000）于3%BSA中 4 ℃溫育過夜。加入二抗后顯影。

1.3.7 細胞培養(yǎng)及轉染

EC109細胞系用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用脂質體介導法，將KAT3b siRNA和陰性對照siRNA分別轉染EC109細胞系。實驗組為KAT3b siRNA組（si-K組），陰性對照組為KAT3b siRNA空載體組（si-N組），空白對照組為空白細胞組 （NC組）。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料資料符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)用x±s表示，計數(shù)資料采用χ2分析，配對樣本采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 食管癌和正常食管黏膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達

免疫組織化學結果顯示，ABCE1在食管癌組織中呈高表達，其陽性表達率為83.64%（46/55），高于正常食管黏膜的23.64%（13/55），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；KAT3b蛋白在食管癌組織和正常黏膜組織中的陽性表達率分別為78.18%（43/55）和25.45%（14/55），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 食管癌和正常食管粘膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達Fig.1 Protein expression of ABCE1 and KAT3b in esophageal cancer and normal esophageal mucosal tissues

2.2 食管癌和正常食管黏膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達

Western blot檢測結果顯示，ABCE1在55例食管癌組織中的表達量為（72.64±2.14）%，高于正常食管黏膜組織中的（18.78±1.86）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。55例食管癌組織中KAT3b表達量為（60.43±1.76）%，高于正常黏膜組織的（10.34±1.62）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 食管癌和正常食管黏膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達Fig.2 ABCE1 and KAT3b protein expression in esophageal cancer and normal esophageal mucosal tissues

2.3 食管癌和食管正常黏膜組織中KAT3b及ABCE1蛋白乙酰化水平

免疫共沉淀實驗結果顯示，在55例食管癌組織中KAT3b蛋白表達量為（60.43±1.76）%，高于正常黏膜組織的（10.34±1.62）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ABCE1蛋白發(fā)生了乙?；湓诎┙M織中的乙?；蕿椋?7.18±3.16）%，顯著高于正常食管黏膜組織的（17.87±1.13）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 食管癌和正常食管粘膜組織中KAT3b蛋白和ABCE1蛋白乙酰化水平 Fig.3 The expression levels of KAT3b and ABCE1 protein acetylation in oesophageal cancer and normal esophageal mucosal tissues

2.4 乙?；D移酶KAT3b以ABCE1為底物催化其發(fā)生乙酰化的預測

生物信息學軟件Acetylation Set Enrichment Based (ASEB)預測結果顯示，乙?；D移酶KAT3b可以將ABCE1蛋白作為底物催化其發(fā)生乙?；?，其可能發(fā)生乙?；馁嚢彼幔↘）為19和397號位點（表1）。

表1 乙酰基轉移酶KAT3b以ABCE1為底物發(fā)生乙?；念A測 Tab.1 The predict of acetyltransferase KAT3b catalyzed ABCE1 for substrate acetylation

2.5 食管癌組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達

熒光免疫組織化學結果顯示，ABCE1和KAT3b蛋白在食管癌組織中同時呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，二者主要表達于細胞質中，部分表達于細胞核中（圖4）。

圖4 免疫熒光組化檢測ABCE1和KAT3b蛋白在食管癌組織中表達Fig.4 Immunofluorescence histochemistry detected the ABCE1 and KAT3b protein expression in esophageal cancer tissues

2.6 食管癌組織中ABCE1乙?；蚄AT3b的相關性

食管癌組織中ABCE1蛋白乙?；蚄AT3b蛋白的表達具有相關性，其相關系數(shù)r=0.414，二者呈正相關（P＜0.05，表2）。

表2 食管癌組織中ABCE1乙酰化與KAT3b表達的相關性 Tab.2 Correlation of ABCE1 acetylation and KAT3b expression in oesophageal cancer tissues

2.7 食管癌組織中ABCE1乙?；癒AT3b與臨床病理學特征的相關性

ABCE1乙?；c食管癌TNM分期、組織分化及淋巴結轉移相關（P＜0.05），與性別及年齡無關（P＞0.05)。KAT3b陽性表達與TNM分期、分化程度及淋巴結轉移密切相關（P＜0.05），與性別及年齡無相關性（P＞0.05，表3）。

表3 食管癌組織中ABCE1乙?；?、KAT3b與臨床病理學特征的關系 Tab.3 Relationship between ABCE1 acetylation and KAT3b and clinicopathological features in esophageal cancer tissue

2.8 si-RNA干擾下調KAT3b效果

合成的si-RNA-KAT3b含有綠色熒光標記的標簽，轉染EC109細胞成功后熒光顯微鏡下可見細胞內有綠色熒光表達（圖5）。RTFQPCR檢測3組細胞KAT3b mRNA相對表達水平。結果顯示，si-K組KAT3b mRNA相對表達量為0.23±0.03，si-N組及NC組表達量分別為1.34±0.12和1.31±0.16。si-K組的mRNA表達量明顯低于si-N組及NC組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05，圖6）。Western blot檢測結果顯示，si-K組KAT3b蛋白表達量顯著低于si-N組及NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖7），說明合成干擾下調KAT3b的RNA序列有效。

圖5 RNA干擾KAT3b轉染EC109細胞熒光顯微鏡觀察結果 Fig.5 Fluorescent microscopy observations of R N A interfering KAT3b transfected EC109 cells

圖6 RNA干擾KAT3b轉染EC109細胞后KAT3b mRNA相對表達量Fig.6 Relative KAT3b mRNA expression after KAT3b transfection with EC109 cells

圖7 RNA干擾KAT3b轉染EC109細胞后KAT3b蛋白表達量 Fig.7 KAT3b protein expression after RNA interfering with KAT3b transfection of EC109 cells

2.9 下調KAT3b對ABCE1蛋白乙?；挠绊?/h3>

免疫共沉淀實驗結果顯示，RNA干擾下調KAT3b 后，si-K組ABCE1乙?；斤@著下降（P＞0.05），而si-N和NC組乙?；讲町悷o統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖8），提示抑制KAT3b的表達可以明顯降低EC109細胞中ABCE1乙酰化水平。Si-K: KAT3b si-RNA group; Si-N: Negative control group; NC: Blank control group.

圖8 RNA干擾KAT3b轉染EC109細胞后ABCE1乙酰化水平 Fig.8 Acetylation levels of ABCE1 after RNA interfering with KAT3b transfection of EC109 cells

3 討 論

食管癌發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時往往已進展至中晚期，故食管癌患者的總體預后不理想。目前食管癌的治療主要以手術和放化療為主，然而，放化療對晚期食管癌患者的緩解率較低，往往會導致多種不良反應［7］。隨著對癌基因的深入研究，靶向治療為食管癌患者提供了更好的選擇。

表觀遺傳學中的乙酰化修飾可以遺傳性地調控基因的表達，并參與大多數(shù)細胞的生物學過程［8］。研究［9-10］證實，蛋白質乙?；揎椩诨虮磉_、調控及癌癥啟動等過程中起著至關重要的作用。ABCE1作為一種高度保守的轉運蛋白，在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中扮演癌基因的角色。研究［3］表明，腫瘤組織中高表達的ABCE1與非小細胞肺癌、膀胱癌及多種腫瘤的細胞增殖、凋亡、轉移及腫瘤耐藥等關系密切。前期研究［11］發(fā)現(xiàn)，ABCE1在肺腺癌組織中呈高表達狀態(tài)，且發(fā)生了乙?；揎?，并與肺腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中ABCE1蛋白呈高表達，而在正常食管黏膜內則呈低表達。本研究結果顯示，ABCE1在食管癌組織中也發(fā)生了乙?；揎棧移湟阴；脚c食管癌的TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移具有明顯的相關性，說明ABCE1是一種乙?；鞍祝移湟阴；揎椏赡軈⑴c了食管癌的增殖、侵襲和轉移。

KAT3b是乙?；D移酶家族中的代表性成員之一，不僅可以催化組蛋白發(fā)生乙?；?，可以催化多種非組蛋白底物發(fā)生乙?；?，并參與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展。本研究證實，食管癌組織中KAT3b蛋白呈高表達，且與腫瘤分期、分化和淋巴結轉移相關。但在食管癌中KAT3b作為乙?；D移酶能否催化ABCE1的乙?；揎椷M而調控食管癌的發(fā)生、發(fā)展需要進一步驗證。本研究通過生物信息學軟件預測顯示，KAT3b可以將ABCE1蛋白作為底物催化其發(fā)生乙?；淇赡馨l(fā)生乙?；馁嚢彼幔↘）為19和397號位點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中ABCE1和KAT3b蛋白共表達于細胞質，且二者呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，說明在食管癌中KAT3b可以與ABCE1相互作用，KAT3b作為乙?；D移酶可能參與ABCE1蛋白的乙?；揎椷^程。進一步通過統(tǒng)計學分析了KAT3b和ABCE1乙?；降南嚓P性，結果表明在食管癌組織中，KAT3b的陽性表達與ABCE1高乙酰化呈正相關，提示KAT3b作為乙酰基轉移酶可能參與ABCE1的乙?；揎?，從而促進食管癌細胞的增殖、侵襲和轉移。

研究［12-13］證實，在不同的腫瘤細胞中通過抑制乙酰化轉移酶途徑抑制腫瘤細胞的作用亦不相同。本研究結果提示食管癌細胞內KAT3b作為乙酰基轉移酶催化了非組蛋白ABCE1的乙?；揎棧M而調控食管癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，在食管癌中KAT3b的表達與ABCE1乙?；矫芮邢嚓P，KAT3b的高表達可能促進了ABCE1的高乙?；癄顟B(tài)，這可能是促進食管癌發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。