徐建云，黃啟英，劉 娟

(江蘇省紡織產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210007)

近年來(lái)，紡織品的綠色安全越來(lái)越受到消費(fèi)者的關(guān)注，紡織品中鉛(Pb)、鎘(Cd)元素超標(biāo)案例不斷被報(bào)道。紡織品與消費(fèi)者密切接觸，其表面殘留的重金屬元素Pb、Cd遷移會(huì)損害人體健康。紡織品是人體攝入Pb、Cd元素的主要來(lái)源之一，檢測(cè)紡織品中的Pb、Cd含量是控制人體Pb、Cd攝入量的重要預(yù)防措施。目前國(guó)內(nèi)普遍依據(jù)GB/T 30157—2013《紡織品 總鉛和總鎘含量的測(cè)定》對(duì)紡織品進(jìn)行測(cè)試[1]，主要采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行測(cè)試，該方法與石墨爐-火焰原子吸收分光光度法為經(jīng)典的兩種重金屬檢測(cè)方法，除此之外，還有電感藕合等離子體質(zhì)譜法、X射線熒光光譜法、基于顯色劑的分光光度法、電化學(xué)分析方法、高效液相色譜法等[2-5]。目前紡織品中重金屬Pb、Cd元素的檢測(cè)方法存在檢測(cè)過(guò)程中依賴大型儀器設(shè)備、設(shè)備昂貴、方法耗時(shí)、儀器使用和維護(hù)成本高、檢測(cè)人員需具備一定的專業(yè)知識(shí)等問(wèn)題，導(dǎo)致上述傳統(tǒng)檢測(cè)方法很難在實(shí)驗(yàn)室推廣，更不適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[7-9]。因此，建立一種操作簡(jiǎn)便、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)紡織品中有害重金屬元素的方法是當(dāng)今行業(yè)內(nèi)的迫切需求[10-11]。

膠體金試紙條法是一種基于金納米粒子(AuNPs)標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)的重金屬Pb、Cd元素檢測(cè)技術(shù)，該類試紙條具有無(wú)背景干擾、肉眼易識(shí)別、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、試劑用量少、無(wú)需任何儀器設(shè)備、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，是目前常用的重金屬Pb、Cd元素快速檢測(cè)方法之一。作者以Pb、Cd單克隆抗體為基礎(chǔ)，研制出一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)紡織品中總Pb、總Cd含量的膠體金試紙條，并采用該膠體金試紙條對(duì)紡織品中總Pb、總Cd含量進(jìn)行篩檢。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試樣與試劑

純棉針織面料：江蘇常熟市富康達(dá)針紡織品有限公司產(chǎn)。

Pb、Cd單克隆抗體：實(shí)驗(yàn)室自制；羊抗小鼠(IgG)：長(zhǎng)春鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；氯金酸(HAuCl4)、牛血清蛋白(BSA)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)；檸檬酸三鈉、氯化鈉、過(guò)氧化氫、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、硝酸、磷酸氫二鈉二水化合物、磷酸二氫鉀：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；玻璃纖維素膜：芬蘭Ahlstrom公司產(chǎn)；硝酸纖維素膜：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)；PVC板、試紙卡、吸水紙：上海杰一生物科技有限公司產(chǎn)；Pb、Cd單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為100 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院產(chǎn)；氬氣：純度大于99.99%，南京紅健氣體有限公司產(chǎn)；超純水：自制。

1.2 儀器

Avio200電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀：美國(guó)鉑金埃爾默公司制；Cary 60紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫公司制；高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司制；BP221S 型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司制；METTLER TOLEDO Seven Compact pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司制；恒溫磁力攪拌器、SHZ-88A 恒溫水浴振蕩器：江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠制；超純水制備裝置：美國(guó)Millipore公司制；CEM MARS6微波消解儀：美國(guó)CEM公司制；HM3030劃膜噴金儀：上海金標(biāo)生物科技有限公司制。

1.3 膠體金探針的制備

1.3.1 AuNPs的制備與表征

參照文獻(xiàn)[12]，通過(guò)熱還原HAuCl4獲得檸檬酸鈉保護(hù)的AuNPs。在快速攪拌的情況下，將15 mL 38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液立即加入到煮沸的150 mL 1.0 mmol/L HAuCl4溶液中，并保持沸騰15 min；連續(xù)攪拌溶液冷卻至室溫，然后通過(guò)0.2 μm濾膜過(guò)濾，得到AuNPs。

1.3.2 Pb及Cd單克隆抗體標(biāo)記膠體金探針的制備與純化

膠體金探針是分別用Pb、Cd單克隆抗體修飾直徑為15 nm的AuNPs來(lái)制備。通過(guò)滴加碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)AuNPs分散液的pH值為8.5，然后取1 mL AuNPs分散液分別與等量Pb、Cd單克隆抗體 (5 μL, 100 nmol/L)混合，逐滴加入抗體溶液，攪拌10 min，靜置10 min，再向管內(nèi)加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PEG溶液，攪拌20 min，混勻靜置老化40 h；在轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心30 min，以去除過(guò)量的試劑；通過(guò)50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)對(duì)沉淀物連續(xù)3次離心-分散進(jìn)行洗滌；最終分散在含有0.1 g/L PEG 的50 mmol/L PBS溶液中(pH值為7.5)，獲得Pb及Cd單克隆抗體標(biāo)記膠體金探針，備用。

1.4 膠體金試紙條的制備

1.4.1 試樣墊及結(jié)合墊的制備

分別取玻璃纖維素膜將其切割成2.0 cm×5.0 cm浸泡于pH值為7.5的PBS溶液中4 ℃過(guò)夜，37 ℃風(fēng)干制成試樣墊、結(jié)合墊，于4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 硝酸纖維素膜的包被加工

取硝酸纖維素膜1條，并切割成2.5 cm×5.0 cm，分別將1.0 mg/mL完全檢測(cè)抗原、羊抗小鼠IgG加入洗凈的劃膜噴金儀噴頭，固定檢測(cè)線和質(zhì)控線位置，進(jìn)行噴膜，待硝酸纖維素膜風(fēng)干，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 膠體金結(jié)合墊的制備

將制備好的Pb及Cd單克隆抗體標(biāo)記膠體金探針?lè)謩e包被于玻璃纖維膜上，風(fēng)干，得到膠體金結(jié)合墊，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 吸收墊的制備

取吸水紙將其切割成2.0 cm×5.0 cm，制備吸收墊，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 膠體金試紙條的組裝

膠體金試紙條的組裝過(guò)程見圖1。在PVC底板上依次將試樣墊、膠體金結(jié)合墊、包被有抗原和IgG的測(cè)試線和控制線的硝酸纖維素膜及吸收墊進(jìn)行組裝，其中，硝酸纖維素膜置于底板中部，結(jié)合墊一邊緣搭于硝酸纖維素膜靠近檢測(cè)線一端，另一端稍重疊于PVC板上，試樣墊一端繼續(xù)疊加在該端膠體金結(jié)合墊，試樣墊另一端貼合于PVC板上，則兩端分別疊加于硝酸纖維素膜、PVC底板上，吸水墊始端疊加于硝酸纖維素膜另一端，吸水墊末端與底板末端對(duì)齊，在保護(hù)膜上印有樣液流動(dòng)箭頭指向標(biāo)記，該保護(hù)膜覆蓋在試樣墊上，最終將組裝好的膠體金試紙條切割成4 mm 寬的試紙條，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 膠體金試紙條組裝示意Fig.1 Schematic diagram of colloidal gold test strip1—試樣墊；2—連接墊/膠體金墊；3—質(zhì)控線；4—吸收墊；5—背襯(底板)；6—檢測(cè)線；7—硝酸纖維素膜

1.5 樣液的制備

1.5.1 試樣前處理

將純棉針織面料試樣剪碎至5 mm×5 mm以下，稱取 0.20 g置于聚四氟乙烯消解容器中；加入7 mL濃硝酸、3 mL雙氧水，待試樣和濃硝酸在室溫下反應(yīng)完全后，將消解容器密封并放置到微波消解儀中，15 min內(nèi)升溫至(180±5) ℃，并在(180±5) ℃ 保持 6 min，取出消解罐，打開前應(yīng)先在通風(fēng)柜中將微波消解罐靜置并冷卻到室溫或冷卻30 min；取出聚四氟乙烯消解罐在加熱板上于100 ℃加熱30 min趕酸，用一級(jí)水分 3 次淋洗，將消解溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用一級(jí)水定容至刻度，搖勻，獲得樣液；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣液pH值為5.5，經(jīng)無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾后，用于測(cè)定紡織品中總Pb、總Cd含量。

1.5.2 0.02 mol/L EDTA溶液的配制

在天平上準(zhǔn)確稱取3.80 g EDTA，溶于100 mL去離子水中，微熱溶解后，轉(zhuǎn)移到500 mL容量瓶中，再加入去離子水定容搖勻。

1.5.3 待測(cè)液的制備

將含有不同質(zhì)量濃度的Cd、Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣液分別與過(guò)量的EDTA螯合溶液(體積比1:1，EDTA過(guò)量)混合，制備Pb-ITCBE、Cd-ITCBE標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液和試樣待測(cè)液。

1.6 試紙條的應(yīng)用及方法評(píng)價(jià)

1.6.1 膠體金試紙條的應(yīng)用

將待測(cè)液滴于試樣墊中，待測(cè)液向吸收墊方向移動(dòng)，到達(dá)結(jié)合墊時(shí)，會(huì)與膠體金復(fù)合物結(jié)合，待測(cè)液中Pb、Cd離子越多，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，與檢測(cè)線上的完全檢測(cè)抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體越少，檢測(cè)線上截留的金標(biāo)抗體越少，顯色越淺，反之，待測(cè)離子越少，檢測(cè)線紅顏色越深；待測(cè)液到達(dá)質(zhì)控線時(shí)，無(wú)論樣液里是否含有待測(cè)Pb、Cd離子，膠體金復(fù)合物均會(huì)與質(zhì)控線上的IgG結(jié)合，質(zhì)控線顯紅色，如果質(zhì)控線不顯色，則測(cè)試結(jié)果為無(wú)效。當(dāng)測(cè)定有效進(jìn)行時(shí)，控制線(C線)一直會(huì)顯示紅色；若不顯色，則測(cè)試無(wú)效。

當(dāng)待測(cè)液中Pb/Cd-ITCBE質(zhì)量濃度小于最低檢出限濃度時(shí)，膠體金結(jié)合墊中的單克隆抗體膠體金復(fù)合物與T線上Cd完全檢測(cè)抗原結(jié)合，檢測(cè)線顯紅。

1.6.2 方法檢出限的測(cè)定

分別將100 μg/mL Pb或Cd的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS配制成Cd濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0 μg/L和Pb濃度為5.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1 mL與EDTA溶液混合反應(yīng)(體積比1:1，EDTA過(guò)量)，最終制備系列標(biāo)準(zhǔn)樣液。取上述100 μL樣液分別滴加至膠體金試紙條的試樣墊上，等待3～5 min后，觀察檢測(cè)線、控制線顯色情況，記錄目測(cè)檢測(cè)線有顯色時(shí)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣液的濃度。以確定試紙條對(duì)待測(cè)重金屬元素的檢出限，進(jìn)一步推算出試紙條對(duì)紡織品中總Cd、總Pb含量的檢出限。

1.6.3 準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

選擇砷(As)、銻(Sb)、鎳(Ni)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)6種金屬離子，分別配成濃度為30 μg/L的水溶液，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.4 重現(xiàn)性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將試紙條放入密封盒中，加入干燥劑，分別于4 ℃、室溫和37 ℃保存1，5，7，8，10，15，30，50，60，70，80 d。取出試紙條，分別滴加濃度為50.0 μg/L的Cd或Pb溶液，考察試紙條在不同存儲(chǔ)溫度及不同存儲(chǔ)時(shí)間下的顯色反應(yīng)。

2 結(jié)果和討論

2.1 AuNPs的表征

采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)(λ)400～600 nm掃描膠體金溶液，得到其吸光度(Abs)。從圖2可以看出，膠體金溶液的最大吸收峰在 523 nm處，無(wú)雜峰，且峰寬較小，表明制備的AuNPs顆粒分布均勻。

圖2 膠體金溶液的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of colloidal gold solution

膠體金溶液的透射電鏡掃描結(jié)果見圖3。

圖3 膠體金溶液的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 Transmission electron microscope photograph of colloidal gold solution

從圖3可以看出，AuNPs顆粒大小均一，經(jīng)計(jì)算，AuNPs直徑在15 nm左右，適合單克隆抗體標(biāo)記，可在試紙條檢測(cè)線上產(chǎn)生可目測(cè)的強(qiáng)烈信號(hào)。AuNPs顆粒表面負(fù)電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。AuNPs對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，蛋白質(zhì)等高分子被吸附到AuNPs顆粒表面，無(wú)共價(jià)鍵形成，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。

2.2 抗體標(biāo)記條件優(yōu)化

用50 mmol/L 的磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值分別至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0；分別取1 mL膠體金溶液，并加入50 μL標(biāo)記抗體，混勻，靜止10 min，再分別加入50 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的NaCl溶液，混勻后靜止3 h，測(cè)定單抗修飾膠體金溶液在吸收波長(zhǎng)570 nm處的Abs。從圖4可以看出，在pH值為7.5及8.5時(shí)，膠體金溶液為透明紅色液體，Abs最大，之后出現(xiàn)顯著下降，在其他pH值時(shí)，AuNPs顆粒出現(xiàn)團(tuán)聚變藍(lán)現(xiàn)象，說(shuō)明在pH值為7.5及8.5時(shí)，膠體金分別與Pb及Cd單抗的吸附較好。在pH值接近于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)或略偏堿性時(shí)，蛋白質(zhì)所處溶解狀態(tài)最適合偶聯(lián)，蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。

圖4 單抗修飾膠體金溶液的Abs隨pH值的變化Fig.4 Change of Abs with pH value of monoclonal antibody modified colloidal gold solution ●—Pb單抗；■—Cd單抗

2.3 Pb及Cd單克隆抗體用量

分別取10份pH值為7.5及8.5的1 mL膠體金溶液，分別加入20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 μL的 Pb及Cd單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，在振蕩器上振蕩混勻10 min，靜置10 min，再分別加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的NaCl溶液，混勻10 min，測(cè)定吸收波長(zhǎng)570 nm處單抗修飾的膠體金溶液的Abs。從圖5可以看出：隨著Pb及Cd單克隆抗體加入量增大，溶液的Abs先增大后降低；在Pb及Cd單克隆抗體加入量分別為50 μL及45 μL時(shí)，單抗修飾膠體金溶液的Abs最大；繼續(xù)添加Pb及Cd單克隆抗體，膠體金溶液的Abs下降，膠體金溶液保持穩(wěn)定紅色。因此， Pb、Cd抗體較佳用量分別為50 μL及45 μL。

圖5 膠體金溶液的Abs隨Pb及Cd單克隆抗體用量的變化Fig.5 Change of Abs of colloidal gold solution with amounts of Pb and Cd monoclonal antibodies ■—Pb單抗；●—Cd單抗

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 方法檢出限

從表1、表2可知：分別用Cd質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0 μg/L和Pb質(zhì)量濃度為5.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液與EDTA進(jìn)行螯合，并用Pb及Cd試紙條檢測(cè)，等待3～5 min，部分試紙條檢測(cè)線、質(zhì)控線顯紅色，Pb及Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為分別為40 μg/L及5.0 μg/L時(shí)，試紙條檢測(cè)線目測(cè)淺紅色，質(zhì)控線顯紅色，判為假陰性；低于此濃度，C 線顯色，T 線目測(cè)顯紅色，初步確定為陰性；分別用高于40 μg/L及5.0 μg/L的Pb及Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試紙條檢測(cè)時(shí)，T線不顯色，C線為紅色條帶，判為陽(yáng)性。因此，分別選擇40 μg/L及5.0 μg/L為Pb及Cd試紙條的檢出限，折算到紡織品試樣中，Pb及Cd試紙條對(duì)Pb及Cd的檢出限分別為5.0 mg/kg及0.625 mg/kg。國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 31701—2015《嬰幼兒及兒童紡織產(chǎn)品安全技術(shù)規(guī)范》規(guī)定紡織品中總Cd含量不超過(guò)100 mg/kg、總Pb含量不超過(guò)90 mg/kg的限量值要求，利用制備的Pb及Cd試紙條測(cè)定紡織品中總Pb、總Cd含量，可以滿足日常檢測(cè)初篩需求。

表1 Pb試紙條對(duì)不同濃度的Pb的靈敏度分析Tab.1 Sensitivity analysis of Pb test strip to Pb of different concentrations

表2 Cd試紙條對(duì)不同濃度的Cd的靈敏度分析Tab.2 Sensitivity analysis of Cd test strip to Cd of different concentrations

2.4.2 方法準(zhǔn)確性

使用Pb及Cd試紙條檢測(cè)其他金屬離子，進(jìn)行選擇性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證試紙條的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表3。

表3 試紙條對(duì)Pb離子及Cd離子的選擇性Tab.3 Selectivity of Pb and Cd ions by strips

從表3可知：采用Pb試紙條分別對(duì)含As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu、Pb離子的溶液進(jìn)行測(cè)試，滴加含有As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu離子的溶液時(shí)，Pb試紙條呈陰性，而滴加含有Pb離子的溶液時(shí)，Pb試紙條呈陽(yáng)性，As、Co、Cd、Cr、Ni、Sb、Cu離子對(duì)Pb試紙條測(cè)試不會(huì)造成干擾；采用Cd試紙條測(cè)試，滴加含有As、Co、Pb、Cr、Ni、Sb、Cu離子的溶液時(shí)，Cd試紙條呈陰性，而滴加含有Cd離子的溶液時(shí)，Cd試紙條呈陽(yáng)性，As、Co、Pb、Cr、Ni、Sb、Cu離子對(duì)Cd試紙條測(cè)試不會(huì)造成干擾。因此，該方法用于測(cè)定紡織品中總Pb、總Cd含量時(shí)都無(wú)假陰性現(xiàn)象，確保了該方法的準(zhǔn)確性。

2.4.3 試紙條穩(wěn)定性

試紙條在不同存儲(chǔ)溫度及不同存儲(chǔ)時(shí)間下的顯色反應(yīng)結(jié)果表明，結(jié)合墊上的Pb及Cd金標(biāo)記抗體在4 ℃下分別保存70 d及50 d內(nèi)，結(jié)合墊上的金標(biāo)探針仍可以完全釋放，沒有出現(xiàn)拖尾及條帶中空現(xiàn)象，檢測(cè)線和控制線顯色情況和保存前一致；結(jié)合墊上的Pb及Cd金標(biāo)記抗體在室溫或37 ℃條件下僅放置10 d，試紙條的活性有所下降。由此可見，本方法的Pb及Cd試紙條具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

a.建立了一種基于Pb、Cd單克隆抗體的膠體金試紙條方法，可用于快速檢測(cè)紡織品中總Pb、總Cd含量。

b.Pb及Cd試紙條對(duì)紡織品中總Pb、總Cd含量的檢出限分別達(dá)到5.0 mg/kg 和0.625 mg/kg，僅需3～5 min 即可便捷實(shí)現(xiàn)試樣中總Pb、總Cd含量的目測(cè)初篩判定；其靈敏度和穩(wěn)定性均能滿足實(shí)際試樣的測(cè)試要求。

c.該方法操作方便、準(zhǔn)確度高，對(duì)Pb、Cd離子的檢測(cè)具有良好的選擇性，適用于紡織品現(xiàn)場(chǎng)快速、批量篩檢。