劉 聰 郭 妍 秦露雪 王軍美 尹孟庭 郭長(zhǎng)青△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化伴骨贅形成及滑膜增生為主要病理改變，以關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的慢性退行性全關(guān)節(jié)病變[1]，是導(dǎo)致老齡化人口疼痛和殘疾的主要原因，患者生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，為家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

在導(dǎo)致KOA的眾多原因中，關(guān)節(jié)軟骨的退化或喪失一直以來(lái)被認(rèn)為是主要原因，但學(xué)者Radin首次提出，在軟骨退變的開(kāi)始和進(jìn)展過(guò)程中軟骨下骨起著重要作用，越來(lái)越多證據(jù)證明了這一觀點(diǎn)，甚至有學(xué)者認(rèn)為軟骨下骨異常重塑可能是KOA發(fā)病的始動(dòng)因素[2-3]。雖然迄今為止仍未能明確直接導(dǎo)致KOA的原因，但軟骨下骨作為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，其重要性已得到公認(rèn)。在膝關(guān)節(jié)中，軟骨下骨為軟骨提供機(jī)械支撐，并與其他關(guān)節(jié)組織共同維護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)和完整性[4]，但在異常機(jī)械應(yīng)力的作用下，軟骨下骨發(fā)生異常骨重塑，主要表現(xiàn)為KOA早期骨吸收，中晚期骨形成[5]，這些變化均導(dǎo)致軟骨下骨剛度發(fā)生改變，其合理分配負(fù)荷的能力降低，導(dǎo)致上覆關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)力增加，進(jìn)而誘發(fā)軟骨退變并進(jìn)一步導(dǎo)致KOA。

近年來(lái)針刀療法在治療KOA中得到了廣泛應(yīng)用，并取得了較好的緩解癥狀和改善關(guān)節(jié)功能的效果。本團(tuán)隊(duì)前期研究也證明了針刀能夠恢復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)良性應(yīng)力刺激、修復(fù)軟骨[6-8]，但對(duì)軟骨下骨異常重塑是否具有調(diào)控作用尚不明確。本研究通過(guò)對(duì)軟骨下骨Micro-CT掃描及三維重建，探究針刀干預(yù)對(duì)軟骨下骨重塑的調(diào)控作用，揭示針刀治療KOA的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)6月齡健康雄性新西蘭兔30只，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供（許可證號(hào)：SCXK京2018-0010），體質(zhì)量2.0～2.5 kg，本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所完成，保證所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，控制室溫20～24℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由獲取食物和水，定期紫外線(xiàn)消毒。

1.2 試劑與儀器

樹(shù)脂繃帶（規(guī)格：15 cm×180 cm，珠海麗珠醫(yī)用生物材料有限公司）；高分子繃帶（規(guī)格7.5 cm×360 cm，蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司）；HZ系列一次性針刀（規(guī)格0.3 mm×30 mm，北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司）；一次性無(wú)菌針灸針（規(guī)格0.2 mm×13 mm，環(huán)球牌，蘇州針灸用品有限公司）；二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，Risedronate sodium，美國(guó)LKT Laboratories公司）；韓式穴位神經(jīng)刺激儀（儀器型號(hào)LH202H，北京華為產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司）；活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)Quantum FX Micro-CT成像系統(tǒng)（儀器型號(hào)PE Quantum FX，美國(guó)PerkinElmer公司）。

1.3 分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只雄性新西蘭兔隨機(jī)分為空白組、模型組、針刀組、電針組和骨代謝調(diào)節(jié)劑組，每組6只。制備KOA模型采用改良Videman法左后肢伸直位固定制動(dòng)。由兩名操作者共同完成，一人將兔仰臥位固定在試驗(yàn)臺(tái)上，另一人進(jìn)行造模操作。操作者一手牽拉兔左后肢，使膝關(guān)節(jié)完全伸直，將樹(shù)脂繃帶于（75±10）℃熱水中浸泡軟化，墊脫脂棉于樹(shù)脂繃帶內(nèi)以減緩壓力，再將兔左后肢用樹(shù)脂繃帶從腹股溝處至足趾固定，保持膝關(guān)節(jié)呈180°伸直位，踝關(guān)節(jié)呈60°背屈，外層用高分子材料進(jìn)行加固，最外層用防啃咬繃帶包裹。保持末端足趾露出，以便觀察血供情況及有無(wú)腫脹。除空白組外，其余4組均按上述方法造模，固定制動(dòng)9周。造模結(jié)束后，用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取1只兔，處死后取膝關(guān)節(jié)軟骨下骨進(jìn)行病理觀察，判斷其病理變化是否符合要求，若顯示造模成功即可拆除所有動(dòng)物的制動(dòng)材料。

1.4 干預(yù)方法

空白組不做任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)，每天正常抓取、固定。模型組造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)，每天正常抓取、固定。針刀組：拆除制動(dòng)材料1周后，給予針刀干預(yù)治療。將KOA兔固定后，在左后肢膝關(guān)節(jié)周?chē)谬埬懽隙ㄎ?，常?guī)備皮、消毒，按照針刀四步進(jìn)針規(guī)程操作，松解完成后取出針刀，用棉球按壓片刻止血。進(jìn)針點(diǎn)及具體針刀操作如下。1）股內(nèi)、外側(cè)肌腱止點(diǎn)：針刀刀刃平行肌腱、刀體與皮膚平面垂直進(jìn)針，松解股內(nèi)、外側(cè)肌腱延續(xù)處。2）股直肌肌腱止點(diǎn)：進(jìn)針?lè)较蛲?，松解髕骨上緣即股直肌肌腱移行處。3）股二頭肌肌腱止點(diǎn)：進(jìn)針?lè)较蛲?，松解股二頭肌肌腱移行處。4）鵝足囊：進(jìn)針?lè)较蛲?，松解鵝足囊，即縫匠肌、股薄肌及半腱肌的聯(lián)合腱，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解。每周治療1次，治療3周。電針組：拆除制動(dòng)材料1周后開(kāi)始電針治療。參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》定位取穴，結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法、比較解剖取穴法及模擬骨度取穴法，選取曲泉、委陽(yáng)、內(nèi)膝眼和外膝眼干預(yù)治療。常規(guī)備皮、消毒，選定穴位后將毫針刺入約5 mm，針刺后接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀以疏密波行刺激治療，電針?lè)謩e連接曲泉與委陽(yáng)，內(nèi)膝眼與外膝眼，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，留針15 min，隔天治療1次，共治療3周。骨代謝調(diào)節(jié)劑組：拆除制動(dòng)材料1周后，皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，Risedronate sodium）0.01 mg/kg體質(zhì)量，每天注射1次，共治療3周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 行為學(xué)觀察 分別于制動(dòng)措施解除后1周與干預(yù)結(jié)束后1周，采用改良Lequesne MG[9]膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)估量表對(duì)各組兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)估，分別從局部疼痛度、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動(dòng)度、關(guān)節(jié)腫脹度4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，總分越高表明膝關(guān)節(jié)功能障礙越嚴(yán)重。由2名人員分別進(jìn)行評(píng)價(jià)后取兩者平均值。

1.5.2 取材 于干預(yù)結(jié)束1周后，用3%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉。左后肢腹股溝至踝關(guān)節(jié)范圍常規(guī)備皮、消毒，在無(wú)菌條件下切取關(guān)節(jié)面上下各2 cm骨的膝關(guān)節(jié)，清除多余軟組織，于-20℃環(huán)境下冷凍保存48 h后，進(jìn)行Micro-CT檢查。

1.5.3 影像學(xué)檢測(cè) 采用Micro-CT進(jìn)行軟骨下骨二維觀察、三維重建及定量分析軟骨下骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化。將兔膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于Micro-CT檢測(cè)艙內(nèi)，用繃帶捆綁固定以防止移位，掃描時(shí)沿標(biāo)本長(zhǎng)軸方向，掃描參數(shù)為：掃描分辨率45 μm，旋轉(zhuǎn)角度210°，旋轉(zhuǎn)角度增量0.5°，層間距20 μm，曝光時(shí)間2 960 ms，掃描時(shí)間18 min，對(duì)同一樣品500張不同截面圖片，選用1 000分割值，完成圖像二值化。三維重建時(shí)選用完整的軟骨下骨組織作為興趣區(qū)域（ROI），選定ROI內(nèi)骨進(jìn)行三維可視化呈現(xiàn)。用Micview V2.1.2三維重建處理軟件和ABA專(zhuān)用骨骼分析軟件進(jìn)行定量分析。測(cè)量參數(shù)有骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數(shù)量（Tb.N）及骨小梁間隔（Tb.Sp），骨密度（BMD），分為組織骨密度（tBMD）與體積骨密度（vBMD），骨體積分?jǐn)?shù)（BVF）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，首先檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性，若呈正態(tài)分布且方差齊則選用單因素方差分析（one-way，ANOVA），若不符合正態(tài)性檢驗(yàn)或方差不齊則選用非參數(shù)檢驗(yàn)法分析。樣本數(shù)據(jù)以（）表示。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔Lequesne MG行為學(xué)評(píng)分比較

見(jiàn)表1。采用改良Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)分量表評(píng)估比較各組兔膝骨關(guān)節(jié)炎級(jí)別。結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組改良Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，針刀組、電針組評(píng)分明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），骨代謝調(diào)節(jié)劑組評(píng)分無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針組與針刀組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組兔Lequesne MG行為學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組兔Lequesne MG行為學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組電針組針刀組骨代謝調(diào)節(jié)劑組n 6 6 6 6 6干預(yù)前0±0 7.00±0.89**7.33±0.82**7.33±0.82**7.17±0.98**干預(yù)后0±0 6.83±0.75**4.57±0.78△△4.57±0.78△△6.83±0.75

2.2 影像學(xué)檢測(cè)

2.2.1 Micro-CT成像 Micro-CT冠狀面二維圖像顯示，空白組軟骨下骨骨小梁呈網(wǎng)格狀均勻有序排列；模型組軟骨下骨骨板增厚，骨小梁局部斷裂扭曲，排列紊亂不均，部分呈融合表現(xiàn)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失；骨代謝調(diào)節(jié)劑組與模型組表現(xiàn)相似；電針組與針刀組較模型組明顯改善，軟骨下骨骨小梁形狀較為規(guī)則，排列較整齊有序。見(jiàn)圖1。三維重建圖可見(jiàn)模型組較空白組軟骨下骨骨髁邊緣生出大量骨贅，電針組與針刀組可見(jiàn)骨贅明顯減少，骨代謝調(diào)節(jié)劑組與模型組差別不明顯。

圖1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨Micro-CT冠狀面二維圖形

2.2.2 各組兔軟骨下骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較 見(jiàn)表2，表3。Micro-CT骨組織參數(shù)定量分析顯示，與空白組相比，模型組Tb.Th、Tb.N、BVF、vBMD及tBMD明顯升高；Tb.Sp明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，針刀組及電針組Tb.Th、Tb.N、BVF、vBMD及tBMD明顯降低；Tb.Sp明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。針刀組與電針組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但針刀組相較電針組Tb.Th、Tb.Sp、vBMD及tBMD的改善趨勢(shì)更為明顯，更接近空白組。骨代謝調(diào)節(jié)劑組對(duì)比模型組各數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組兔軟骨下骨骨小梁厚度、間隔、數(shù)量參數(shù)比較（±s）

表2 各組兔軟骨下骨骨小梁厚度、間隔、數(shù)量參數(shù)比較（±s）

組別空白組模型組電針組針刀組骨代謝調(diào)節(jié)劑組n 6 6 6 6 6 Tb.Th（mm）0.618±0.074 0.818±0.069**0.671±0.048△△0.704±0.068**△△0.774±0.062**Tb.Sp（mm）0.770±0.094 0.671±0.043**0.755±0.040△△0.718±0.036△△0.640±0.058**Tb.N（1/mm）0.688±0.052△△0.821±0.055**0.727±0.095△0.722±0.058△0.760±0.073

表3 各組兔軟骨下骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)參數(shù)比較（±s）

表3 各組兔軟骨下骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)參數(shù)比較（±s）

組別空白組模型組電針組針刀組骨代謝調(diào)節(jié)劑組n 6 6 6 6 6 BVF（%）76.62±4.78 94.75±3.82**81.18±7.68△△81.67±3.67△△87.28±8.47**vBMD（mg/cm3）1 808.76±59.14 2 361.48±333.46**1 977.68±187.01△△2 028.32±115.78△2 323.40±257.50**tBMD（mg/cm3）2 371.71±57.95 2 945.82±239.80**2 479.25±320.68△△2 628.21±232.50△2 754.77±218.23**

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選用新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，兔易于獲取和飼養(yǎng)，關(guān)節(jié)體積較大，其大體結(jié)構(gòu)與人類(lèi)關(guān)節(jié)相似，取材時(shí)操作方便，可用于實(shí)驗(yàn)觀察的組織多[10]。目前常用的KOA模型的制備方法大致分為手術(shù)法和非手術(shù)法，非手術(shù)法中較為常見(jiàn)的有關(guān)節(jié)制動(dòng)和關(guān)節(jié)腔注射，前期研究表明各種原因引起的膝周生物力學(xué)失衡是導(dǎo)致KOA的重要因素，因此關(guān)節(jié)制動(dòng)法更能復(fù)刻出力學(xué)失衡環(huán)境下導(dǎo)致KOA的發(fā)病過(guò)程，故本實(shí)驗(yàn)采用改良Videman法制備動(dòng)物模型。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明軟骨下骨在KOA發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。在膝關(guān)節(jié)中軟骨下骨位于軟骨下方，由軟骨下骨板和軟骨下骨小梁兩部分組成，具有吸收機(jī)械應(yīng)力、緩沖振動(dòng)和維持關(guān)節(jié)正常形態(tài)等功能。正常情況下，軟骨下骨可緩沖關(guān)節(jié)內(nèi)約30%的機(jī)械應(yīng)力，從而避免過(guò)于集中的應(yīng)力對(duì)關(guān)節(jié)軟骨造成的損害[11]。軟骨下骨重塑在生理狀態(tài)下始終處于動(dòng)態(tài)平衡，在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共同作用下，維持軟骨下骨微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保證關(guān)節(jié)能夠適應(yīng)日常機(jī)械負(fù)荷[12]。但當(dāng)機(jī)械應(yīng)力超過(guò)關(guān)節(jié)的適應(yīng)能力時(shí)，該動(dòng)態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致軟骨下骨出現(xiàn)異常重塑，在KOA早期，骨吸收占主導(dǎo)，在中晚期，骨形成占主導(dǎo)。具體表現(xiàn)為早期破骨細(xì)胞降解活性增強(qiáng)，骨吸收增多，致使軟骨下骨呈骨質(zhì)疏松樣改變。但骨體積減小后對(duì)異常應(yīng)力的負(fù)荷能力下降，為維持正常的生物力學(xué)性能，中晚期時(shí)成骨細(xì)胞的成骨活性增強(qiáng)，骨形成明顯，骨小梁由原先稀疏多孔變得逐漸致密化，軟骨下骨板增厚[13-14]。上述改變導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)機(jī)械應(yīng)力分布不均，軟骨下骨吸收機(jī)械應(yīng)力和緩沖震蕩的能力下降，使軟骨過(guò)度負(fù)荷，進(jìn)而出現(xiàn)磨損和退變，軟骨退變又反作用于軟骨下骨，進(jìn)一步加劇異常骨形成，加速KOA的發(fā)生發(fā)展[15]。有大量研究證實(shí)，通過(guò)改善異常骨形成，使軟骨下骨向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)化，對(duì)外界應(yīng)力的承受能力增強(qiáng)，延緩軟骨退變，達(dá)到緩解KOA的目的。

Micro-CT是近年來(lái)新興的能夠精確顯示骨顯微結(jié)構(gòu)的設(shè)備，有分辨率高、檢查速度快、無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，相較于傳統(tǒng)的X線(xiàn)、CT和骨密度測(cè)量等方法，可以更精確地測(cè)量出所需數(shù)據(jù)，同時(shí)兼具三維重建的功能，彌補(bǔ)了二維圖像無(wú)法判斷骨小梁三維結(jié)構(gòu)的不足，在研究骨的結(jié)構(gòu)及力學(xué)分析方面得到了廣泛的應(yīng)用[16]。

在此次研究中，我們通過(guò)Micro-CT對(duì)軟骨下骨二維觀察、三維重建并檢測(cè)其顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在造模9周后模型組兔膝關(guān)節(jié)二維冠狀面出現(xiàn)骨小梁排列不均，斷裂融合等現(xiàn)象，三維重建顯示骨髁邊緣骨贅增多，顯微結(jié)構(gòu)顯示軟骨下骨Tb.Th、BVF、Tb.N、BMD均明顯升高，Tb.Sp明顯降低，是中晚期KOA的明確特征[17]。證明在異常機(jī)械應(yīng)力的作用下，軟骨下骨出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)上的改變，干預(yù)治療后，針刀和電針組兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨贅明顯減少，Tb.Th、BVF、Tb.N、BMD均顯著降低，Tb.Sp升高，針刀組較電針組改善趨勢(shì)更明顯，證明針刀可改善軟骨下骨骨形成。

KOA屬中醫(yī)學(xué)“膝痹病”的范疇，隨著病程的進(jìn)展病位由“筋”發(fā)展至“骨”?！端貑?wèn)·痿論》曰“宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也”，闡明了筋的作用，即“筋”發(fā)生病變，其協(xié)理關(guān)節(jié)的功能失常，若不加以干預(yù)將進(jìn)展發(fā)生“骨病”，而“骨病”又會(huì)反作用于筋，加重“筋傷”，二者相互影響，最終導(dǎo)致“筋錯(cuò)縫”“骨出槽”的病理狀態(tài)?！端貑?wèn)·調(diào)經(jīng)論》中指出“病在筋，調(diào)之筋；病在骨，調(diào)之骨”，是后世有效治療KOA的思路來(lái)源。針刀在臨床上的治療原則不僅僅是對(duì)壓痛點(diǎn)及因應(yīng)力失衡代償形成的條索狀物進(jìn)行“燔針劫刺”，還對(duì)周?chē)c維持膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)平衡起關(guān)鍵作用的軟組織進(jìn)行松解，進(jìn)一步達(dá)到“調(diào)筋”的目的，通過(guò)重塑關(guān)節(jié)內(nèi)部的良性應(yīng)力平衡，有效緩解軟骨下骨異常重塑和軟骨降解從而達(dá)到“治骨”的目的，為打破“筋骨同病”的惡性循環(huán)提供突破口，對(duì)治療KOA有重要意義。

二磷酸鹽是一種有效的骨吸收抑制劑，主要作用是抑制破骨細(xì)胞的降解活性，可以有效減少軟骨下骨骨量的丟失，使軟骨下骨微結(jié)構(gòu)維持正常狀態(tài)[18]，但在本次實(shí)驗(yàn)中，骨代謝調(diào)節(jié)劑組與模型組各項(xiàng)數(shù)據(jù)均未見(jiàn)顯著差異，我們推測(cè)可能是因?yàn)槎姿猁}的抑制作用主要針對(duì)破骨細(xì)胞，而本實(shí)驗(yàn)造模9周后模型兔KOA已發(fā)展至中晚期，軟骨下骨以成骨細(xì)胞的成骨作用為主，主要表現(xiàn)為異常骨形成，因此二磷酸鹽的作用不明顯。

綜上所述，針刀通過(guò)對(duì)膝關(guān)節(jié)局部組織進(jìn)行松解，可有效改善中晚期軟骨下骨的異常骨重塑，延緩KOA的進(jìn)展，對(duì)于治療KOA有重要意義。