何露 陽(yáng)姣 吳梅 熊濤 張翅

[華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000]

中藥注射劑安全性問題的日益突出[1]，要求不斷提高中藥注射劑的質(zhì)量水平，加強(qiáng)中藥注射劑生產(chǎn)過(guò)程中安全性研究已成為焦點(diǎn)。生產(chǎn)過(guò)程中的安全性主要體現(xiàn)在熱原方面。熱原是微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)[2]。極微量（1～5 ng/kg）的內(nèi)毒素進(jìn)入人體即可引起發(fā)熱反應(yīng)[3]。藥品中的熱原主要是細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強(qiáng)的是革蘭陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽(yáng)性桿菌類，革蘭陽(yáng)性球菌則較弱，霉菌、酵母菌甚至病毒也能產(chǎn)生熱原[4]。熱原通常是磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物。磷脂多醇是復(fù)合物的活性中心，致熱作用最強(qiáng)，其化學(xué)組成因菌種不同而有所差異，分子量為5×104～5×105，分子量越大致熱作用越強(qiáng)。熱原具有耐熱性、濾過(guò)性、水溶性、不揮發(fā)性、吸附性，能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑及超聲波破壞等特點(diǎn)[5]。

中藥注射液熱原主要是生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染引起[6]。在中藥注射液生產(chǎn)過(guò)程中，加強(qiáng)提取過(guò)程和制劑過(guò)程等生產(chǎn)過(guò)程的監(jiān)測(cè)對(duì)保證產(chǎn)品質(zhì)量控制非常重要。本研究針對(duì)有代表性的參附注射液、參麥注射液、生脈注射液、紅花注射液4種中藥注射劑生產(chǎn)過(guò)程中熱原安全性問題進(jìn)行研究，進(jìn)行家兔熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的比較研究，為4種中藥注射液乃至中藥注射液的熱原安全性檢查方式提供一定研究思路和新的檢測(cè)模式。

1 材料與方法

1.1 儀器

DHG-9246A電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LKL164-03動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀（英國(guó)萊伯金耐特）；XW-80A旋渦混懸儀（上海馳唐電子有限公司）；WRY-2015微機(jī)熱原測(cè)溫儀（上海遼卓科貿(mào)有限公司）；DJ-06WH電子天平（成都倍賽克儀器所）；移液槍（100～1 000 μL，梅特勒）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，80 EU/支150601-201886）；動(dòng)態(tài)濁度法用鱟試劑（廣東湛江安度斯有限公司，0.01～10 EU/支1806210）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（廣東湛江安度斯有限公司，30 mL/瓶，1810180）。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品

生脈注射液（XT-180901XT-180902-1XT-180903，180904010180905010180901020）；參附注射液（XT-180806XT-180807XT-180901，180905010180906010180907010）；參麥注射液（XT-180903-1XT-180901-1XT-180902-1，181001010180903020180905020）；紅花注射液（XT-180901/01-02XT-180905/05-06XT-180913/13-14，181001010181002010181002010）。提取液：4個(gè)品種提取液各3批次按照注射劑比例配制后，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成全量，采用50 mL已除熱原的玻瓶和膠塞進(jìn)行包裝，按照產(chǎn)品對(duì)應(yīng)的滅菌參數(shù)滅菌后待用。成品制劑：4個(gè)提取液對(duì)應(yīng)生產(chǎn)的4個(gè)成品制劑各3批次。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)家兔，日本大耳白，普通級(jí)，雌雄兼有，體質(zhì)量1.7～4.0 kg，160只，購(gòu)于四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-14，飼養(yǎng)于華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司檢測(cè)中心大興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樓家兔飼養(yǎng)區(qū)，非屏障系統(tǒng)。飼養(yǎng)溫度17～25℃，濕度40%～70%，12/12 h明暗交替照明，單籠飼養(yǎng)，無(wú)墊料，每天自動(dòng)沖洗糞便。飼料為兔全價(jià)顆粒飼料，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供。飲水為清潔自來(lái)水。

1.5 細(xì)菌內(nèi)毒素限制（L）的確定

L=K/M，K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h）。紅花注射液限值L為7.5 EU/mL，結(jié)合臨床用藥、實(shí)際生產(chǎn)、檢驗(yàn)及樣品實(shí)際情況，為更好地控制生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)菌內(nèi)毒素，將紅花注射劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限值標(biāo)準(zhǔn)提高為0.5 EU/mL，高于計(jì)算結(jié)果的要求，故最大稀釋倍數(shù)計(jì)算時(shí)，L取值0.5 EU/mL。

1.6 光度法鱟試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)

1.6.1 鱟試劑準(zhǔn)備 取鱟試劑（0.1～10 EU/支）1支，在安瓶頸劃痕，用浸泡過(guò)異丙醇的無(wú)紡布擦拭后從頸部處折斷（避免玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)引起干擾）。用無(wú)熱原的刻度吸管或移液器準(zhǔn)確吸取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1.25 mL沿瓶壁加入安瓿內(nèi)，輕輕搖勻，使內(nèi)容物全部溶解（避免產(chǎn)生氣泡）。取反應(yīng)試管11支，分別按1.5、0.15、0.015 EU/mL各濃度平行3管，陰性平行2管。

1.6.2 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，在安瓿頂端劃痕，用浸泡過(guò)異丙醇的無(wú)紡布擦拭后從劃痕處折斷（避免玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)引起干擾）。加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合，然后進(jìn)行稀釋，分別得到1.5、0.15、0.015 EU/mL濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均在旋渦混合器上混合30 s。

1.7 供試品干擾實(shí)驗(yàn)

藥典或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中或有其他內(nèi)毒素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中已有規(guī)定的品種，可直接進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，如在檢驗(yàn)中出現(xiàn)干擾的情況需再進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；其他未建立內(nèi)毒素檢查的品種需先進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，確定限值和不干擾濃度后再進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。

1.7.1 供試品的最大有效稀釋倍數(shù) 最大稀釋倍數(shù)計(jì)算：MVD=CL/λ=（0.5 EU/mL）/（0.03 EU/mL）=16.6倍。按用法用量和限值計(jì)算公式計(jì)算出來(lái)，限值L為7.5 EU/mL，結(jié)合臨床用藥、實(shí)際生產(chǎn)、檢驗(yàn)及樣品實(shí)際情況，為更好地控制生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)菌內(nèi)毒素，將紅花注射劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限值標(biāo)準(zhǔn)提高為0.5 EU/mL，高于計(jì)算結(jié)果的要求，故最大稀釋倍數(shù)計(jì)算時(shí)，L取的值為0.5 EU/mL。

1.7.2 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備（C溶液） 按照“1.6.2”進(jìn)行內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備，得到濃度分別為1.5、0.3、0.15、0.015 EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.7.3 供試品溶液配制（A溶液）

1.7.4 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液配制（B溶液）

1.7.5 加樣及反應(yīng) 取2支鱟試劑，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將其復(fù)溶，復(fù)溶后將軟件進(jìn)入待采集狀態(tài)。將3支復(fù)溶好的鱟試劑溶液合并在一起，輕輕混勻避免產(chǎn)生氣泡。將鱟試劑分裝于32支反應(yīng)試管中，0.1 mL/管；將相應(yīng)的溶液A、B、C、D加至反應(yīng)管中，0.1 mL/管，每個(gè)濃度平行2管，將反應(yīng)混合液混勻（在漩渦混懸儀上輕點(diǎn)一下即可）?；靹蚝髮⒎磻?yīng)管插入動(dòng)態(tài)試管儀開始反應(yīng)，然后填寫試驗(yàn)參數(shù)，如試劑批號(hào)、各反應(yīng)孔的反應(yīng)項(xiàng)目及參數(shù)等。與鱟試劑反應(yīng)將A、B、C溶液與鱟試劑各25 μL，加入BET檢查反應(yīng)微孔板，每個(gè)濃度均平行測(cè)2孔，BET水作為陰性對(duì)照（即D溶液），平行測(cè)2孔。依照用動(dòng)態(tài)試管測(cè)試儀測(cè)定。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程計(jì)算各供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液的內(nèi)毒素含量Ct和CS，按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）：R=（CS-Ct）/λm×100%，無(wú)干擾濃度回收率在50%～200%。

1.8 家兔熱原檢查

按《中國(guó)藥典》現(xiàn)行版四部通則熱原檢查法進(jìn)行操作，選符合規(guī)定的家兔，試驗(yàn)前1 h停止給飼料和水，稱重后置于家兔固定盒內(nèi)。每隔30 min測(cè)量家兔體溫1次，測(cè)2次，2次體溫之差不得超過(guò)0.2℃，以此2次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。每批供試品選用3只家兔。在測(cè)定正常體溫后15 min內(nèi)給藥，給藥后每隔30 min測(cè)量體溫1次，共6次。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為L(zhǎng)gTg=2.8916-0.2753LgC，相關(guān)系數(shù)（r）絕對(duì)值為0.997，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間＞3 600 s，反應(yīng)重復(fù)管的變異系數(shù)（CV）均≤10%（表1），標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)成立，表明試驗(yàn)方法有效。

表1 動(dòng)態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 供試品干擾試驗(yàn)

采用細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)4個(gè)注射劑品種從提取液到成品制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定，并同步進(jìn)行熱原檢查。通過(guò)兩個(gè)結(jié)果之間的比較證明中藥注射劑采用細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定法與熱原檢查結(jié)果是否存在一定的相關(guān)性。

4個(gè)注射劑品種提取液和對(duì)應(yīng)的成品制劑細(xì)菌內(nèi)毒素含量按照現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》1 143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行測(cè)定。見表2。

表2 4種注射劑品種細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.3 檢查結(jié)果

提取液、成品制劑的熱原檢查按照現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》1 142熱原檢查法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。通過(guò)對(duì)12批提取液和對(duì)應(yīng)的12批成品制劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定，可以看出提取液細(xì)菌內(nèi)毒素含量低，則對(duì)應(yīng)的成品制劑內(nèi)毒素含量也低。用家兔法進(jìn)行熱原檢查對(duì)應(yīng)的24批次產(chǎn)品均合格，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原結(jié)果均較穩(wěn)定，有一定的相關(guān)性。試驗(yàn)中比較了4種注射液（參麥注射液、生脈注射液、參附注射液、紅花注射液）生產(chǎn)過(guò)程中的家兔熱原法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（動(dòng)態(tài)濁度法），為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了一定的研究思路和理論依據(jù)，基于上述的比較研究，提示細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可作為4種注射液過(guò)程控制中熱原檢查的補(bǔ)充方法，更好地控制質(zhì)量。

表3 4種注射劑品種細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定方法統(tǒng)計(jì)表

3 討 論

中藥注射劑是我國(guó)特有的劑型，依據(jù)中醫(yī)辨證施治理論，依據(jù)現(xiàn)代工藝制備得到，近些年來(lái)的重大公共衛(wèi)生事件中，中藥注射劑在其中扮演了不可或缺的角色。參附注射液、參麥注射液、生脈注射液等一系列中藥注射劑先后被列入2003年《傳染性非典型肺炎（SARS）中醫(yī)診療指南）》[7]、2010年《手足口病診療指南》[8]、2013年《人感染H7N9禽流感診療方案》[9]、2014年《登革熱診療指南》[10]、2015年《中東呼吸綜合征病例診療方案》[11]、2021年《新型冠狀病毒肺炎診療方案》[12]，在歷次防治重大急性傳染病中發(fā)揮了重要作用。中藥注射劑成分復(fù)雜，生產(chǎn)工藝周期普遍較長(zhǎng)，在生產(chǎn)過(guò)程中存在著較多的未知因子，尤其需要在內(nèi)毒素方面進(jìn)行監(jiān)控。參附注射液、參麥注射液、生脈注射液、紅花注射液4種中藥注射劑，為臨床常用藥，對(duì)于這類療效確切的中藥注射品種尤其需要加強(qiáng)熱原的檢測(cè)，不僅有利于臨床安全使用，而且對(duì)于生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的熱原控制也具有顯著意義[13-14]。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法的機(jī)制在于微量的內(nèi)毒素與鱟試劑中的C因子發(fā)生反應(yīng)[15]，激活凝固酶，切斷凝固蛋白特定位置的精胺酸肽鍵，形成凝固蛋白，產(chǎn)生凝膠過(guò)程的濁度變化，根據(jù)測(cè)定到達(dá)事先設(shè)定反應(yīng)液的濁度變化值所需要的時(shí)間對(duì)數(shù)與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度對(duì)數(shù)的反比關(guān)系定量供試品內(nèi)毒素水平。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法具有檢測(cè)范圍寬、準(zhǔn)確、靈敏、可重復(fù)及快速等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法是FDA認(rèn)可的檢查法，該法已成為細(xì)菌內(nèi)毒素定量法的主流，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法檢測(cè)陽(yáng)性的注射液患者死亡率可達(dá)66.7%[16]。

表4 4種注射劑提取液和成品制劑細(xì)菌內(nèi)毒素及熱原檢查結(jié)果

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)12批中藥提取液和對(duì)應(yīng)的12批成品制劑通過(guò)動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定，檢測(cè)出的細(xì)菌內(nèi)毒素含量與對(duì)應(yīng)的成品制劑的含量存在一定的相關(guān)性。同時(shí)用家兔法對(duì)12批提取液和對(duì)應(yīng)的12批成品制劑進(jìn)行熱原檢查，其結(jié)果均合格，進(jìn)一步說(shuō)明以上4個(gè)中藥注射劑品種建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可以作為熱原檢查的補(bǔ)充試驗(yàn)方法。