何露 陽姣 吳梅 熊濤 張翅

[華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000]

中藥注射劑安全性問題的日益突出[1]，要求不斷提高中藥注射劑的質量水平，加強中藥注射劑生產過程中安全性研究已成為焦點。生產過程中的安全性主要體現(xiàn)在熱原方面。熱原是微生物產生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質[2]。極微量（1～5 ng/kg）的內毒素進入人體即可引起發(fā)熱反應[3]。藥品中的熱原主要是細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、尸體及內毒素。致熱能力最強的是革蘭陰性桿菌的產物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌甚至病毒也能產生熱原[4]。熱原通常是磷脂多醇與蛋白質結合而成的復合物。磷脂多醇是復合物的活性中心，致熱作用最強，其化學組成因菌種不同而有所差異，分子量為5×104～5×105，分子量越大致熱作用越強。熱原具有耐熱性、濾過性、水溶性、不揮發(fā)性、吸附性，能被強酸、強堿、強氧化劑及超聲波破壞等特點[5]。

中藥注射液熱原主要是生產過程中微生物污染引起[6]。在中藥注射液生產過程中，加強提取過程和制劑過程等生產過程的監(jiān)測對保證產品質量控制非常重要。本研究針對有代表性的參附注射液、參麥注射液、生脈注射液、紅花注射液4種中藥注射劑生產過程中熱原安全性問題進行研究，進行家兔熱原檢查法和細菌內毒素檢查法的比較研究，為4種中藥注射液乃至中藥注射液的熱原安全性檢查方式提供一定研究思路和新的檢測模式。

1 材料與方法

1.1 儀器

DHG-9246A電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LKL164-03動態(tài)試管檢測儀（英國萊伯金耐特）；XW-80A旋渦混懸儀（上海馳唐電子有限公司）；WRY-2015微機熱原測溫儀（上海遼卓科貿有限公司）；DJ-06WH電子天平（成都倍賽克儀器所）；移液槍（100～1 000 μL，梅特勒）。

1.2 實驗試劑

細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，80 EU/支150601-201886）；動態(tài)濁度法用鱟試劑（廣東湛江安度斯有限公司，0.01～10 EU/支1806210）；細菌內毒素檢查用水（廣東湛江安度斯有限公司，30 mL/瓶，1810180）。

1.3 實驗樣品

生脈注射液（XT-180901XT-180902-1XT-180903，180904010180905010180901020）；參附注射液（XT-180806XT-180807XT-180901，180905010180906010180907010）；參麥注射液（XT-180903-1XT-180901-1XT-180902-1，181001010180903020180905020）；紅花注射液（XT-180901/01-02XT-180905/05-06XT-180913/13-14，181001010181002010181002010）。提取液：4個品種提取液各3批次按照注射劑比例配制后，用細菌內毒素檢查用水配制成全量，采用50 mL已除熱原的玻瓶和膠塞進行包裝，按照產品對應的滅菌參數(shù)滅菌后待用。成品制劑：4個提取液對應生產的4個成品制劑各3批次。

1.4 實驗動物

實驗家兔，日本大耳白，普通級，雌雄兼有，體質量1.7～4.0 kg，160只，購于四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場，動物生產許可證號：SCXK（川）2018-14，飼養(yǎng)于華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司檢測中心大興實驗動物樓家兔飼養(yǎng)區(qū)，非屏障系統(tǒng)。飼養(yǎng)溫度17～25℃，濕度40%～70%，12/12 h明暗交替照明，單籠飼養(yǎng)，無墊料，每天自動沖洗糞便。飼料為兔全價顆粒飼料，由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供。飲水為清潔自來水。

1.5 細菌內毒素限制（L）的確定

L=K/M，K為人每千克體質量每小時最大可接受的細菌內毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h）。紅花注射液限值L為7.5 EU/mL，結合臨床用藥、實際生產、檢驗及樣品實際情況，為更好地控制生產過程中的細菌內毒素，將紅花注射劑的細菌內毒素限值標準提高為0.5 EU/mL，高于計算結果的要求，故最大稀釋倍數(shù)計算時，L取值0.5 EU/mL。

1.6 光度法鱟試劑標準曲線可靠性試驗

1.6.1 鱟試劑準備 取鱟試劑（0.1～10 EU/支）1支，在安瓶頸劃痕，用浸泡過異丙醇的無紡布擦拭后從頸部處折斷（避免玻璃屑落入瓶內引起干擾）。用無熱原的刻度吸管或移液器準確吸取細菌內毒素檢查用水1.25 mL沿瓶壁加入安瓿內，輕輕搖勻，使內容物全部溶解（避免產生氣泡）。取反應試管11支，分別按1.5、0.15、0.015 EU/mL各濃度平行3管，陰性平行2管。

1.6.2 內毒素標準溶液準備 取細菌內毒素工作標準品1支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，在安瓿頂端劃痕，用浸泡過異丙醇的無紡布擦拭后從劃痕處折斷（避免玻璃屑落入瓶內引起干擾）。加入規(guī)定量的細菌內毒素檢查用水溶解其內容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合，然后進行稀釋，分別得到1.5、0.15、0.015 EU/mL濃度的細菌內毒素標準溶液，每稀釋一步均在旋渦混合器上混合30 s。

1.7 供試品干擾實驗

藥典或國家標準中或有其他內毒素檢驗標準中已有規(guī)定的品種，可直接進行內毒素檢查，如在檢驗中出現(xiàn)干擾的情況需再進行干擾實驗的驗證；其他未建立內毒素檢查的品種需先進行干擾實驗，確定限值和不干擾濃度后再進行內毒素檢查。

1.7.1 供試品的最大有效稀釋倍數(shù) 最大稀釋倍數(shù)計算：MVD=CL/λ=（0.5 EU/mL）/（0.03 EU/mL）=16.6倍。按用法用量和限值計算公式計算出來，限值L為7.5 EU/mL，結合臨床用藥、實際生產、檢驗及樣品實際情況，為更好地控制生產過程中的細菌內毒素，將紅花注射劑的細菌內毒素限值標準提高為0.5 EU/mL，高于計算結果的要求，故最大稀釋倍數(shù)計算時，L取的值為0.5 EU/mL。

1.7.2 內毒素標準溶液的制備（C溶液） 按照“1.6.2”進行內毒素標準溶液的制備，得到濃度分別為1.5、0.3、0.15、0.015 EU/mL的內毒素標準溶液。

1.7.3 供試品溶液配制（A溶液）

1.7.4 供試品陽性對照溶液配制（B溶液）

1.7.5 加樣及反應 取2支鱟試劑，用細菌內毒素檢查用水將其復溶，復溶后將軟件進入待采集狀態(tài)。將3支復溶好的鱟試劑溶液合并在一起，輕輕混勻避免產生氣泡。將鱟試劑分裝于32支反應試管中，0.1 mL/管；將相應的溶液A、B、C、D加至反應管中，0.1 mL/管，每個濃度平行2管，將反應混合液混勻（在漩渦混懸儀上輕點一下即可）?；靹蚝髮⒎磻懿迦雱討B(tài)試管儀開始反應，然后填寫試驗參數(shù)，如試劑批號、各反應孔的反應項目及參數(shù)等。與鱟試劑反應將A、B、C溶液與鱟試劑各25 μL，加入BET檢查反應微孔板，每個濃度均平行測2孔，BET水作為陰性對照（即D溶液），平行測2孔。依照用動態(tài)試管測試儀測定。按照標準曲線所得回歸方程計算各供試品溶液和含標準內毒素溶液的內毒素含量Ct和CS，按下式計算該試驗條件下的回收率（R）：R=（CS-Ct）/λm×100%，無干擾濃度回收率在50%～200%。

1.8 家兔熱原檢查

按《中國藥典》現(xiàn)行版四部通則熱原檢查法進行操作，選符合規(guī)定的家兔，試驗前1 h停止給飼料和水，稱重后置于家兔固定盒內。每隔30 min測量家兔體溫1次，測2次，2次體溫之差不得超過0.2℃，以此2次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。每批供試品選用3只家兔。在測定正常體溫后15 min內給藥，給藥后每隔30 min測量體溫1次，共6次。

2 結 果

2.1 標準曲線可靠性試驗

標準曲線方程為LgTg=2.8916-0.2753LgC，相關系數(shù)（r）絕對值為0.997，陰性對照的反應時間＞3 600 s，反應重復管的變異系數(shù)（CV）均≤10%（表1），標準曲線試驗成立，表明試驗方法有效。

表1 動態(tài)濁度法標準曲線可靠性試驗結果

2.2 供試品干擾試驗

采用細菌內毒素動態(tài)濁度法對4個注射劑品種從提取液到成品制劑的細菌內毒素含量測定，并同步進行熱原檢查。通過兩個結果之間的比較證明中藥注射劑采用細菌內毒素定量測定法與熱原檢查結果是否存在一定的相關性。

4個注射劑品種提取液和對應的成品制劑細菌內毒素含量按照現(xiàn)行版《中國藥典》1 143細菌內毒素檢查法中的動態(tài)濁度法進行測定。見表2。

表2 4種注射劑品種細菌內毒素干擾試驗結果

2.3 檢查結果

提取液、成品制劑的熱原檢查按照現(xiàn)行版《中國藥典》1 142熱原檢查法進行測定，結果見表3。通過對12批提取液和對應的12批成品制劑進行細菌內毒素含量測定，可以看出提取液細菌內毒素含量低，則對應的成品制劑內毒素含量也低。用家兔法進行熱原檢查對應的24批次產品均合格，進一步說明細菌內毒素和熱原結果均較穩(wěn)定，有一定的相關性。試驗中比較了4種注射液（參麥注射液、生脈注射液、參附注射液、紅花注射液）生產過程中的家兔熱原法和細菌內毒素檢查法（動態(tài)濁度法），為該品種質量標準的提高提供了一定的研究思路和理論依據(jù)，基于上述的比較研究，提示細菌內毒素檢查法可作為4種注射液過程控制中熱原檢查的補充方法，更好地控制質量。

表3 4種注射劑品種細菌內毒素含量測定方法統(tǒng)計表

3 討 論

中藥注射劑是我國特有的劑型，依據(jù)中醫(yī)辨證施治理論，依據(jù)現(xiàn)代工藝制備得到，近些年來的重大公共衛(wèi)生事件中，中藥注射劑在其中扮演了不可或缺的角色。參附注射液、參麥注射液、生脈注射液等一系列中藥注射劑先后被列入2003年《傳染性非典型肺炎（SARS）中醫(yī)診療指南）》[7]、2010年《手足口病診療指南》[8]、2013年《人感染H7N9禽流感診療方案》[9]、2014年《登革熱診療指南》[10]、2015年《中東呼吸綜合征病例診療方案》[11]、2021年《新型冠狀病毒肺炎診療方案》[12]，在歷次防治重大急性傳染病中發(fā)揮了重要作用。中藥注射劑成分復雜，生產工藝周期普遍較長，在生產過程中存在著較多的未知因子，尤其需要在內毒素方面進行監(jiān)控。參附注射液、參麥注射液、生脈注射液、紅花注射液4種中藥注射劑，為臨床常用藥，對于這類療效確切的中藥注射品種尤其需要加強熱原的檢測，不僅有利于臨床安全使用，而且對于生產各環(huán)節(jié)的熱原控制也具有顯著意義[13-14]。

細菌內毒素檢測法的機制在于微量的內毒素與鱟試劑中的C因子發(fā)生反應[15]，激活凝固酶，切斷凝固蛋白特定位置的精胺酸肽鍵，形成凝固蛋白，產生凝膠過程的濁度變化，根據(jù)測定到達事先設定反應液的濁度變化值所需要的時間對數(shù)與細菌內毒素濃度對數(shù)的反比關系定量供試品內毒素水平。細菌內毒素檢測法具有檢測范圍寬、準確、靈敏、可重復及快速等優(yōu)點。細菌內毒素檢測法是FDA認可的檢查法，該法已成為細菌內毒素定量法的主流，細菌內毒素檢測法檢測陽性的注射液患者死亡率可達66.7%[16]。

表4 4種注射劑提取液和成品制劑細菌內毒素及熱原檢查結果

本試驗通過對12批中藥提取液和對應的12批成品制劑通過動態(tài)濁度法進行細菌內毒素含量測定，檢測出的細菌內毒素含量與對應的成品制劑的含量存在一定的相關性。同時用家兔法對12批提取液和對應的12批成品制劑進行熱原檢查，其結果均合格，進一步說明以上4個中藥注射劑品種建立細菌內毒素檢查法可以作為熱原檢查的補充試驗方法。