周文佳 尚云峰 朱文新 楊 卓 盧雪笛 申 楠 向黎黎 陸小龍△ 熊 輝（.湖南省岳陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng) 000；.湖南省常德市第一中醫(yī)院，湖南 常德5000；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 0005；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 0007）

骨折可通過(guò)手術(shù)或者復(fù)位后愈合，但仍有5%～10%的臨床患者在治療后出現(xiàn)骨不連[1]，不愈合引起的疼痛，肢體功能障礙和心理障礙給患者和家庭帶來(lái)的痛苦是巨大的，增加了家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療方法包括去除變硬的骨頭、清潔未連接的末端組織、切髓腔、固定或骨移植[3]，但對(duì)于萎縮性骨不連，治療效果卻不如人意。盡管在臨床中可以通過(guò)簡(jiǎn)單的壓迫或藥物來(lái)促進(jìn)骨折愈合，但其愈合機(jī)制仍不清楚。中醫(yī)藥在治療骨折方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以桃紅四物湯為代表的方劑在治療臨床骨不連及促進(jìn)骨折愈合的方面療效顯著，但其內(nèi)在作用機(jī)制仍不夠明確。為了進(jìn)一步探索骨折的不愈合和愈合的機(jī)制，許多學(xué)者在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方面進(jìn)行了相關(guān)研究，其中以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與Hippo-YAP信號(hào)通路兩個(gè)靶點(diǎn)最受關(guān)注。本研究從實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步論證桃紅四物湯促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和潛在開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的理論依據(jù)以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠10只，雌雄不拘，遠(yuǎn)交系，清潔級(jí)，用于分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；Wistar大鼠共40只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，用于含藥血清的制備；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試藥與儀器 桃紅四物湯湯劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科提供，根據(jù)《醫(yī)宗金鑒》記載，并規(guī)范為現(xiàn)代超微顆粒藥物劑量，主要成分：桃仁20 g，紅花10 g，生地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g，當(dāng)歸20 g。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，多聚甲醛、胰蛋白酶購(gòu)自上海寶曼公司，茜素紅、雙抗、CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京雷根公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、30%甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自上海伊塔生物科技公司，Verteporfin購(gòu)自上海雅吉生物科技，過(guò)硫酸銨、甘氨酸、枸櫞酸鈉、水合氯醛購(gòu)自上海生工，PVDF膜、5%脫脂奶粉購(gòu)自北京沃凱生物科技，RealBand蛋白預(yù)染Marker、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自蘇州新賽美，BeyoCoLorTM彩色預(yù)染蛋白、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液（強(qiáng)）、20×TBS緩沖液購(gòu)自上海碧云天公司。桃紅四物湯含藥血清的制備：桃紅四物湯以0.3㎏大鼠的給藥劑量為0.36 g/d灌胃，對(duì)照組0.9%氯化鈉注射液等體積灌胃，制備血清滅活補(bǔ)體后，低溫冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分離及培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉斷頸處死，95%酒精浸泡2 h，分離大腿股骨及脛骨，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗股和脛骨髓腔，收集沖洗液，補(bǔ)充含20%胎牛血清及1%鏈霉素。然后，將骨髓細(xì)胞懸液通過(guò)70 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，通過(guò)300 r/min的離心機(jī)分離，會(huì)出現(xiàn)上層清液及下層沉淀物質(zhì)，取下層。加雙倍血清和雙抗，24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，棄掉未貼壁細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)物保持在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。每2天更換1次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞亞融合，融合程度達(dá)到80%及胰蛋白酶被消耗后，按照1∶2比例培養(yǎng)，傳代。將培養(yǎng)的第3代BMSCs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組及干預(yù) 將所培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞置于含15%胎牛血清的DMEM/F12低糖培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/L，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于96孔培養(yǎng)板。將96孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞隨機(jī)分為3組，空白血清組、桃紅四物湯含藥血清組（THSWT組）、桃紅四物湯含藥血清+Verteporfin組（THSWT+V組）。各組細(xì)胞干預(yù)方法：待細(xì)胞融合2 d后，加入含藥血清開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)。空白血清組：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培養(yǎng)基+空白血清進(jìn)行培養(yǎng)。THSWT組：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培養(yǎng)基+桃紅四物湯含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)。THSWT+V組：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培養(yǎng)基+桃紅四物湯含藥血清+Verteporfin進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）細(xì)胞增殖活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（CCK-8實(shí)驗(yàn)）：將BMSCs置于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)皿中饑餓24 h，然后在含有1% FBS的正常DMEM培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，向孔板中加入定量CCK-8試劑溶液均勻，然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到37℃、5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后檢測(cè)。在第0、1、3和7天通過(guò)CCK-8測(cè)定法分析BMSCs細(xì)胞增殖能力。2）堿性磷酸酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（ALP）：干預(yù)結(jié)束后，根據(jù)ALP試劑盒提供的方案進(jìn)行ALP測(cè)定，比較使用不同方法干預(yù)BMSCs后的結(jié)果。3）茜素紅染色實(shí)驗(yàn)：干預(yù)21 d后，將BMSCs置在培養(yǎng)皿中用緩沖液浸洗3次；4%多聚甲醛中固定30 min，緩沖液浸洗3次，茜素紅染色液染色20 min；染色完畢后沖洗，然后在光鏡下可觀察到橘紅色的鈣沉積陽(yáng)性細(xì)胞，比較各組之間的差異。4）Western blotting實(shí)驗(yàn)：提取BMSCs細(xì)胞蛋白并定量。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，將膜與一抗在4℃孵育過(guò)夜，然后二抗孵育，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)膜上的信號(hào)，并使用Image-J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以（）表示，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)并符合正態(tài)性，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs免疫表型特征 見(jiàn)圖1。流式鑒定BMSCs免疫表型特征：CD44、CD29和 CD105陽(yáng)性，CD34、CD45陰性，符合BMSCs細(xì)胞特征。

圖1 BMSCs免疫表型特征

2.2 CCK-8細(xì)胞增殖活力結(jié)果 見(jiàn)圖2。對(duì)比空白組含藥血清及桃紅四物湯含藥血清，后者干預(yù)下的BMSCs細(xì)胞增殖速度明顯增快（P＜0.01），當(dāng)我們使用Verteporfin阻斷Hippo信號(hào)通路后，發(fā)現(xiàn)BMSCs細(xì)胞的增殖速度明顯減慢（P＜0.01）。

圖2 各組BMSCs細(xì)胞增殖活力

2.3 ALP、茜素紅染色分析BMSCs骨向分化程度 見(jiàn)圖3。ALP檢測(cè)顯示：BMSCs的成骨分化程度顯著降低。使用Hippo通路阻斷劑Verteporfin后，茜素紅染色顯示鈣鹽沉積明顯減少。

圖3 各組BMSCs骨向分化

2.4 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)圖4，圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入Hippo信號(hào)通路抑制劑后，成骨分化關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)明顯減低（P＜0.01），但其蛋白表達(dá)高于空白血清組（P＜0.01）。桃紅四物湯含藥血清干預(yù)與空白組含藥血清干預(yù)后的Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵因子表達(dá)，結(jié)果顯示YAP蛋白表達(dá)降低，TAZ蛋白表達(dá)增高（P＜0.01）。

圖4 成骨因子蛋白表達(dá)

圖5 Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白

3 討論

骨折是世界范圍內(nèi)重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，老年人口比例的激增，使得發(fā)病率和住院率進(jìn)一步增加，由此產(chǎn)生昂貴的經(jīng)濟(jì)成本[4-5]。高齡人群骨折后愈合變得更加緩慢和困難，這種情況導(dǎo)致了許多骨折患者在經(jīng)歷了復(fù)雜型骨折或者骨折合并其他并發(fā)癥時(shí)，會(huì)出現(xiàn)骨缺損或者骨不連的癥狀[6-8]。嚴(yán)重的骨缺損及骨不連會(huì)導(dǎo)致局部肢體的萎縮和功能喪失，嚴(yán)重影響患者的正常生活，是造成早期殘疾的重要影響因素[9]。因此，我們?cè)絹?lái)越需要開(kāi)發(fā)改善骨折愈合速度以預(yù)防骨缺損和骨不連的治療策略。

BMSCs是骨損傷細(xì)胞療法和組織工程中最常用的干細(xì)胞[10]。當(dāng)骨折發(fā)生時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至骨病變并分化為成骨細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)以促進(jìn)骨折愈合，BMSCs的遷移和成骨分化受多種細(xì)胞信號(hào)等的調(diào)控，比如Hippo-YAP信號(hào)通路、Wnt通路、FAK通路等，提高BMSCs的成骨分化能力對(duì)于骨缺損和骨不連的治療至關(guān)重要[11]。

桃紅四物湯源自《醫(yī)宗金鑒》，全方由6味藥組成，皆為活血化瘀藥，桃仁及紅花化瘀行血，當(dāng)歸及川芎活血行血，輔之熟地黃、芍藥活血柔血。本課題組對(duì)桃紅四物湯開(kāi)展了許多臨床及實(shí)驗(yàn)研究，其中臨床研究結(jié)果表明：桃紅四物湯能促進(jìn)早期及中期骨折的修復(fù)，并縮短骨折愈合時(shí)間，預(yù)防骨缺損和骨不連[12]。桃紅四物湯能在骨折的不同時(shí)間段維持VEGF蛋白的高表達(dá)，并且能促進(jìn)骨痂微血管的新生，從而促進(jìn)骨折的愈合[13]。研究表明：VEGF蛋白的表達(dá)增高可以通過(guò)其對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的作用激活YAP，激活YAP誘導(dǎo)一個(gè)轉(zhuǎn)錄程序來(lái)進(jìn)一步控制細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)[14]。前期的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)[15]：維持骨折斷端骨痂VEGF的高水平是桃紅四物湯促進(jìn)骨折愈合的關(guān)鍵所在，也是促進(jìn)BMSCs細(xì)胞遷徙、歸巢的重要條件。桃紅四物湯在促進(jìn)VEGF表達(dá)的同時(shí)，同時(shí)也激活了Hippo-YAP信號(hào)通路。Hippo信號(hào)通路下游的YAP與TAZ共同激活RUNX2以驅(qū)動(dòng)BMSCs的成骨細(xì)胞分化并抑制成脂過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPAR）誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[16-18]。

Hippo信號(hào)通路在BMSCs成骨分化過(guò)程中十分重要，YAP及TAZ蛋白在下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄作用更是必不可少，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在桃紅四物湯含藥血清中加入Hippo信號(hào)通路阻斷劑Verteporfin后，相比較沒(méi)有使用Verteporfin桃紅四物湯含藥血清干預(yù)下的BMSCs，其增殖活力和成骨分化能力顯著下降，這說(shuō)明桃紅四物湯在促進(jìn)骨折愈合中BMSCs增殖和成骨分化的關(guān)鍵通路包含Hippo-YAP，Hippo-YAP信號(hào)通路介導(dǎo)了桃紅四物湯促進(jìn)骨折早期愈合的過(guò)程，其影響主要在于BMSCs細(xì)胞的增殖和成骨分化。隨著細(xì)胞標(biāo)記，檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，希望我們能在未來(lái)的時(shí)間中進(jìn)一步探尋桃紅四物湯對(duì)BMSCs的影響，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究添磚加瓦。