譚亞芳 黃昭龍 祁建勇 于 娟 張敏州△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006）

近年來，心血管疾病的患病率和死亡人數(shù)不斷上 升，其中心衰是心血管疾病中造成死亡的重大原因之一，嚴(yán)重危害人類健康[1-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心衰病機(jī)演變主要為“氣虛-血瘀”[4]。通冠膠囊是根據(jù)鄧鐵濤教授學(xué)術(shù)思想和臨證經(jīng)驗(yàn)擬方而成，由黃芪、丹參、水蛭等組成，秉承益氣活血通絡(luò)的治法，在防治急性心梗、冠脈再狹窄方面，有良好的作用。GATA4在心血管疾病發(fā)揮重要作用[5-7]，是多種刺激和信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子。GATA4轉(zhuǎn)錄活性可被病理性刺激相關(guān)的多個(gè)信號(hào)通路正性調(diào)節(jié)，如ERK1/2、p38、Akt及CnA/NFATc3通路[8-11]等。本研究以通冠膠囊為干預(yù)藥物，探究ERK1/2/GATA4信號(hào)通路與氣虛血瘀致心衰的關(guān)系，闡明通冠膠囊治療氣虛血瘀致心衰的相關(guān)機(jī)制，為心衰的治療提供新的作用靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性18個(gè)月齡C57BL/6J老年小鼠48只（批號(hào)：44002100015531），均購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)過嚴(yán)格及合格的檢疫。實(shí)驗(yàn)及飼養(yǎng)方案均遵照《中華人民共和國動(dòng)物處理?xiàng)l例》（條例號(hào)：552001），并且所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)允許下進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑 通冠膠囊主要由黃芪、丹參、水蛭、冰片組成，由廣東省中醫(yī)院生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z20071034，生產(chǎn)批號(hào)：050802。異丙腎上腺素（SIGMA公司），美托洛爾（SIGMA公司），P-ERK抗體（Cell Signaling Technology，美國），GATA4抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），GAPDH抗體（Cell signaling Technology，美國），鼠二抗（Cell signaling Technology，美國），兔二抗（Cell signaling Technology，美國）。

1.3 模型制備 本實(shí)驗(yàn)采用的雄性18個(gè)月齡的C57BL/6J老年小鼠在中醫(yī)辨證中屬于氣虛證候，心力衰竭在中醫(yī)理論中屬于血瘀證，通過皮下注射異丙腎上腺素（30 mg/kg）造成的老年小鼠心衰模型即可辨證為氣虛血瘀致心力衰竭模型，小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)下降至45%以下，左心室收縮末期內(nèi)徑和左心室舒張末期內(nèi)徑均增大，可判斷模型復(fù)制成功[12-14]。

1.4 分組及給藥 將48只C57BL/6J老年小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、通冠膠囊組、美托洛爾組，各12只。實(shí)驗(yàn)第1周連續(xù)7 d給藥，通冠膠囊組灌胃通冠膠囊0.5 g/kg，美托洛爾組腹腔注射美托洛爾30 mg/kg，每天1次。第2周繼續(xù)給藥，除空白對(duì)照組外，其他3組同時(shí)皮下注射異丙腎上腺素30 mg/kg，每天1次。空白對(duì)照組生理鹽水灌胃1 mL，每天1次，持續(xù)2周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）給藥結(jié)束后，各組小鼠進(jìn)行心臟超聲，檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末前壁厚度（LVAWd）、左室收縮末前壁厚度（LVAWs）、左室收縮末內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末后壁厚度（LVPWd）、左室收縮末后壁厚度（LVPWs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室短軸縮短率（FS）。2）超聲結(jié)束后，處死小鼠取心、肺等組織，迅速稱量，同時(shí)解剖脛骨，游標(biāo)卡尺讀出長(zhǎng)度，計(jì)算心/脛比，肺/脛比。最后1 d禁食12 h，灌胃給藥2 h后注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，解剖心肝肺后稱重，心臟快速稱重，切取左心室置于液氮中-80℃保存。3）將保存于-80℃冰箱中的小鼠心臟樣本取出后，于冰上切取約100 mg心臟組織。以眼科剪剪碎組織于勻漿管，加入1 mL裂解液，于勻質(zhì)儀至勻漿完全；于冰上裂解30 min，再次勻漿。勻漿后于4℃以12 000 r/min速度離心5 min，取上清液；BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白濃度，計(jì)算上樣體積。蛋白上樣，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，加入相應(yīng)稀釋比例的第一抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，更換二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液處理，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，分析P-ERK及GATA4蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18統(tǒng)計(jì)軟件。采用LSD-t的方法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟超聲數(shù)據(jù)比較 見表1。與空白對(duì)照組比較，模型組 LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF、FS均有明顯減小（P＜0.01），LVIDs有明顯增大（P＜0.01）。與模型組比較，通冠膠囊組LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF、FS均有明顯增大（P＜0.01），LVIDs有明顯減少（P＜0.01），但通冠膠囊組與空白對(duì)照組以及美托洛爾組比較，以上指標(biāo)皆無明顯差異（P＞0.05）。1個(gè)心動(dòng)周期內(nèi)，模型組的左室腔室在舒張期到收縮期的變化幅度比空白對(duì)照組??；通冠膠囊組與模型組比較，幅度變大，并且通冠膠囊組與空白對(duì)照組及美托洛爾組比較，變化幅度差別不明顯。

表1 各組小鼠心臟超聲數(shù)據(jù)比較（±s）

表1 各組小鼠心臟超聲數(shù)據(jù)比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01。下同。

組別空白對(duì)照組模型組美托洛爾組通冠膠囊組n 12 12 12 12 LVAWd（mm）0.696±0.001△0.558±0.025 0.693±0.001△0.701±0.002△LVAWs（mm）1.054±0.007△0.765±0.062 1.075±0.001△1.031±0.005△LVIDs（mm）2.444±0.003△2.850±0.081 2.442±0.008△2.449±0.007△LVPWd（mm）0.705±0.001△0.580±0.029 0.704±0.001△0.706±0.002△LVPWs（mm）1.023±0.006△0.753±0.055 1.040±0.007△1.008±0.003△EF（%）59.669±0.298△41.580±2.652 60.607±0.431△58.489±0.296△FS（%）30.977±0.213△19.860±1.466 31.648±0.302△30.150±0.205△

2.2 各組小鼠心/脛比、肺/脛比較 見表2。模型組心/脛比及肺/脛比與空白對(duì)照組比較明顯增大（P＜0.05），進(jìn)一步說明造模成功。通冠膠囊組及美托洛爾組的心/脛比及肺/脛比與模型組比較明顯減?。≒＜0.05），但通冠膠囊組與美托洛爾組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），這說明通冠膠囊能夠改善心肌重構(gòu)情況，進(jìn)而改善心衰。

表2 各組小鼠心/脛比、肺/脛比的比較（±s）

表2 各組小鼠心/脛比、肺/脛比的比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型組美托洛爾組通冠膠囊組n 12 12 12 12心/脛比0.075±0.0112△0.096±0.010 0.081±0.009△0.083±0.010△肺/脛比0.081±0.007△0.098±0.004 0.087±0.005△0.085±0.003△

2.3 各組小鼠P-ERK以及GATA4表達(dá)量比較 見圖1，表3。模型組P-ERK以及GATA4表達(dá)量與空白對(duì)照組比較均明顯增加（P＜0.05），說明ERK1/2/GATA4通路與氣虛血瘀致心衰密切相關(guān)。通冠膠囊組及美托洛爾組的P-ERK以及GATA4表達(dá)量與模型組比較明顯減少（P＜0.05），且通冠膠囊組與美托洛爾組比較，P-ERK以及GATA4的表達(dá)量均無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠P-ERK及GATA4表達(dá)條帶

表3 各組小鼠P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值（±s）

表3 各組小鼠P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值（±s）

組別空白對(duì)照組模型組美托洛爾組通冠膠囊組n 12 12 12 12 P-ERK/GAPDH 0.507±0.115△1.110±0.227 0.660±0.070△0.550±0.044△GATA4/GAPDH 0.634±0.092△1.162±0.329 0.588±0.084△0.547±0.058△

3 討 論

通冠膠囊秉承中醫(yī)益氣活血的治療思路，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用多種益氣活血中藥炮制而成，包括了黃芪、丹參、水蛭和冰片。黃芪補(bǔ)中益氣為君藥；丹參活血化瘀為臣藥；水蛭破血逐瘀通絡(luò)，冰片通竅，共為佐使；4藥共奏益氣活血、祛瘀通脈之功。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通冠膠囊對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷有治療效果[13]。本實(shí)驗(yàn)采用雄性18個(gè)月齡的C57BL/6J老年小鼠皮下注射ISO的方法造模，能夠穩(wěn)定地復(fù)制出心衰模型。ISO引起的心梗后心衰是一個(gè)成熟可復(fù)制的心衰模型，伴隨心臟肥厚、心肌缺血、心肌細(xì)胞死亡、心臟纖維化和心律失常。兒茶酚胺類血管活性劑可調(diào)節(jié)心功能。低劑量時(shí)，它們會(huì)產(chǎn)生正性肌力作用；而大劑量時(shí)對(duì)心臟有損傷作用。ISO是一種合成的兒茶酚胺和腎上腺素能激動(dòng)劑，能誘導(dǎo)大鼠心臟損傷。本次實(shí)驗(yàn)建立的氣虛血瘀致心力衰竭模型通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證造模成功，并且在心衰病變進(jìn)程中，屬于失代償期的心衰。

本實(shí)驗(yàn)通過整體水平和分子水平兩個(gè)層面來分析通冠膠囊的作用，小鼠超聲結(jié)果表明，通冠膠囊組的LVAWd、LVAWs、LVIDs、LVPWd、LVPWs與模型組具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，通冠膠囊組的LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs較模型組增大，通冠膠囊組的LVIDs與模型組比較減小，通冠膠囊組的LVAWd、LVAWs、LVIDs、LVPWd、LVPWs與美托洛爾組相比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且通冠膠囊組與對(duì)照組比較，以上指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明通冠膠囊組的左心室腔室縮小到接近正常水平。通冠膠囊組的EF、FS與模型組具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，通冠膠囊組的EF、FS與模型組比較增大，通冠膠囊組的EF、FS與美托洛爾組比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且通冠膠囊組與對(duì)照組比較，以上指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明了通冠膠囊組小鼠心臟收縮力恢復(fù)至接近正常水平。小鼠取材結(jié)果表明，通冠膠囊組的心/脛比以及肺/脛比與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，通冠膠囊組的心/脛比以及肺/脛比均比模型組的小，并且通冠膠囊組的心/脛比以及肺/脛比與美托洛爾組以及空白對(duì)照組比較，以上指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明心肌肥大與心衰的情況正在改善。綜上，我們可以在整體水平說明通冠膠囊具有改善氣虛血瘀致心衰的作用。Western blotting的結(jié)果表明，通冠膠囊組的P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，通冠膠囊組的P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值均比模型組小，并且通冠膠囊組的P-ERK/GAPDH以及GATA4/GAPDH灰度值比值與美托洛爾組以及空白對(duì)照組比較，以上指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，我們認(rèn)為ERK1/2/GATA4信號(hào)通路與氣虛血瘀致心力衰竭的病變過程密切相關(guān)，氣虛血瘀過度激活ERK1/2/GATA4信號(hào)通路，導(dǎo)致心肌重構(gòu)，進(jìn)而引起心衰的發(fā)生。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通冠膠囊能減小心肌梗死面積，改善心梗后心功能，通過調(diào)節(jié)自噬減少心肌細(xì)胞凋亡。并且通冠膠囊能抑制心房纖維化及心室纖維化，減少房顫及室性心律失常的發(fā)生率。本研究同樣證實(shí)，通冠膠囊對(duì)氣虛血瘀致心力衰竭有改善的作用，其干預(yù)作用的分子機(jī)制是通過抑制ERK1/2/GATA4信號(hào)通路，降低P-ERK的表達(dá)，然后根據(jù)P-ERK與GATA4的正向調(diào)節(jié)關(guān)系，減少GATA4的表達(dá)量，最終改善心肌重構(gòu)情況，從而達(dá)到治療心衰的效果。