黃 陳， 余 丹， 楊海峰△

（1江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎為特征的慢性炎癥性疾病，具體病因不明?；ぱ资荝A 的基本病理變化，RA 患者滑膜中炎癥因子顯著增加，滑膜細(xì)胞增生，單核細(xì)胞浸潤及血管翳侵入性生長，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞以及關(guān)節(jié)功能障礙。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型通過Ⅱ型膠原誘發(fā)大鼠免疫反應(yīng)，導(dǎo)致效應(yīng)T 細(xì)胞活化，血漿及滑膜腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 水平顯著升高［1-2］，多種炎性細(xì)胞因子聚集于關(guān)節(jié)局部，使滑膜細(xì)胞充血、水腫、增生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹；隨著病情進(jìn)展，血管翳生成并向軟骨表面浸潤生長，逐漸破壞軟骨組織，最終導(dǎo)致軟骨下骨破壞、纖維性或骨性強(qiáng)直以及關(guān)節(jié)畸形。CIA 與RA 具有相似的免疫學(xué)和病理學(xué)特征，是國內(nèi)外研究RA 發(fā)病機(jī)制和檢測治療的經(jīng)典動物模型。

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是ATP結(jié)合盒蛋白（ATP-binding cassette protein）家族的重要成員，屬于外排轉(zhuǎn)運(yùn)體。P-gp 的底物非常廣泛，如抗腫瘤藥物依托泊苷、吉非替尼和氨甲蝶呤（methotrexate，MTX），鈣離子抑制劑非諾地平和維拉帕米（verapamil）等［3］。P-gp 表達(dá)及功能的變化會影響其底物在體內(nèi)的暴露水平，例如腸道P-gp 功能抑制顯著上調(diào)大鼠體內(nèi)他克莫司和環(huán)孢素血藥濃度［4］。臨床上奎尼丁與地高辛合用，由于奎尼丁對腸道P-gp 的抑制作用，使地高辛吸收速度顯著增加，患者地高辛的血藥濃度顯著增加［5］。急性炎癥狀態(tài)下大鼠肝臟P-gp 泛素化增加，同時 P-gp 表達(dá)水平下調(diào)［6］。盡管在嚙齒類動物的研究結(jié)果表明，P-gp 的表達(dá)往往在炎性刺激（如脂多糖或松節(jié)油）作用下顯著下調(diào)，但是報道的抑制時間并不一致，可能與刺激炎癥反應(yīng)的試劑、劑量及暴露時間有關(guān)［7-，9］。炎癥因子IL-1和IL-6 會導(dǎo)致小鼠肝臟 P-gp 表達(dá)下調(diào)［10］，然而卻上調(diào) Caco-2 細(xì)胞上 P-gp 的表達(dá)［11］，提示炎癥對于不同組織P-gp 的調(diào)控存在組織特異性。本實驗以CIA 大鼠和大鼠滑膜細(xì)胞為實驗材料，觀察RA 狀態(tài)下大鼠滑膜細(xì)胞P-gp表達(dá)的變化，以臨床治療RA的首選藥物和聯(lián)合治療的基本藥物MTX 及熒光染料羅丹明123（rhodamine 123，Rho123）為探針評價滑膜細(xì)胞中P-gp 的功能，初步探討滑膜細(xì)胞P-gp 表達(dá)與炎癥及藥物攝取的關(guān)系。

材料和方法

1 動物

24只清潔級雌性 Wistar 大鼠，180~200 g（6~8 周齡），購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（滬）2008-0016］，飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物房。動物實驗的所有相關(guān)過程均得到江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 藥品與試劑

牛Ⅱ型膠原購自Chrondex；弗氏不完全佐劑（Sigma）購自上海恒渡生物科技有限公司；Ⅱ型膠原酶（Sigma）購自上海谷研實業(yè)有限公司；TRIpure 總RNA 提取試劑購自艾德萊生物科技有限公司；ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TUNDERBIRD?SYBR qPCR Master Mix 均購自 Toyobo；RIPA 裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）和BCA試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；PVDF 膜購自 Millipore；兔源 β-actin 多克隆抗體、羊抗兔Ⅱ抗和羊抗小鼠Ⅱ抗購自Bioworld Technology；vimentin 抗體（sc-6260）購自 Santa Cruz Biotechnology；Alexa Flour 647 購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MTX、Rho123和維拉帕米購自阿拉丁科技有限公司。

3 細(xì)胞

RAW 264.7 細(xì)胞（ATCC）購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；LightCycler 96 全自動熒光定量 PCR 系統(tǒng)（Roche）；Centrifuge 5430R 高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；Tanon 5200 Multi 全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

5 主要方法

5.1 動物分組及造模 清潔級Wistar大鼠24只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組和造模組，每組12只。依據(jù) Trentham 等［12］建立的 CIA 模型構(gòu)建方法，將含膠原2 g/L 的膠原溶液與弗氏不完全佐劑等體積混合，用研缽研磨，使之充分乳化。于造模組大鼠尾根部0.5 cm 處進(jìn)行皮內(nèi)注射（每只200μL）。第7天時，在離尾根部1.5 cm 處注射同劑量II 型膠原乳化劑加強(qiáng)免疫。造模前（0 d）及造模后3、6、9、12、15、18、21 和23 d 進(jìn)行稱重、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分及螺旋測微器測量右足厚度。于第23天處死，分離膝關(guān)節(jié)滑膜組織。AI 評分標(biāo)準(zhǔn)［13］：0分，無紅腫；1分，局限于踝關(guān)節(jié)或跗骨紅斑和輕微腫脹；2 分，踝關(guān)節(jié)到跗骨關(guān)節(jié)紅斑或輕微腫脹；3 分，踝關(guān)節(jié)到跖骨紅斑和中度腫脹；4 分，踝關(guān)節(jié)到趾骨全部足爪腫脹。累計四肢關(guān)節(jié)的得分為每只大鼠的AI，最高16分。

5.2 滑膜細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 （1）大鼠滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)［14］：3只 Wistar 大鼠脫頸處死，將大鼠仰位固定，酒精消毒，沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關(guān)節(jié)，打開膝關(guān)節(jié)腔。用刀片完整剝離滑膜組織，放入 Hanks＇平衡鹽溶液（Hanks＇ balanced salt solution，HBSS）中。轉(zhuǎn)至超凈臺，用HBSS 漂洗3次。眼科剪將滑膜組織切成1 mm3的小塊，加入5 mL Ⅱ型膠原酶（4 g/L），進(jìn)行消化，消化過程中每隔1 h 震搖一次培養(yǎng)瓶。待消化3 h 后，紗布過濾，過200 目篩網(wǎng)。將其轉(zhuǎn)入 15 mL 離心管中，1 800×g離心5 min。棄去含膠原酶的培養(yǎng)液，新鮮DMEM 培養(yǎng)液重懸，接種到25 mL 培養(yǎng)瓶中。每日觀察細(xì)胞，匯合度到90%時傳代。原代培養(yǎng)10 d 后可傳代，取第3~5 代進(jìn)行實驗。（2）滑膜細(xì)胞鑒定：單層生長細(xì)胞，接種在含蓋玻片的24 孔板，待細(xì)胞生長匯合度60%左右，PBS（pH 7.4）清洗2 遍；4%多聚甲醛室溫下固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；5%山羊血清封閉液（含0.3% Triton X-100）室溫封閉60 min；加入vimentin 抗體（1∶200）4 ℃過夜，PBS 漂洗3 次，每次5 min；Alexa Flour 647（1∶500）室溫避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；使用含DAPI的封片劑封片；熒光顯微鏡觀察熒光染色。

5.3 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液（macrophage-conditioned medium，MCM）的制備 高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)RAW 264.7 細(xì)胞，待RAW 264.7 細(xì)胞生長至 80%后，更換成新鮮DMEM。12 h 后匯合度達(dá)95%左右，收集培養(yǎng)液。將收集到的培養(yǎng)液與新鮮DMEM以1∶1混合，得到50%MCM，用于培養(yǎng)造模。

5.4 RT-qPCR （1）RNA 提?。簩⒋笫蠡ぜ?xì)胞以每孔約1×105的細(xì)胞數(shù)接種于12 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%。更換培養(yǎng)液，分為普通DMEM組和50% MCM組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入TRIpure?總RNA 提取試劑1 mL，反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移至1.5 mL 無核酸酶離心管中。加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩后室溫放置15 min。在4 ℃、12 000×g離心10 min后，吸取上層清液400 μL。加入500 μL 異丙醇，顛倒混勻10 次后室溫放置10 min。在4 ℃、12 000×g離心10 min后，輕輕棄去上層清液，加入75%乙醇1 mL，輕彈管底，使沉淀懸浮。在4 ℃、8 000×g離心5 min后，輕輕棄去上層清液，靜置使溶劑揮發(fā)，根據(jù)沉淀量加入DEPC水靜置溶解并測定 RNA 濃度。（2）逆轉(zhuǎn)錄和 qPCR：使用 ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TUNDERBIRD?SYBR qPCR Master Mix 進(jìn)行 qPCR。目的基因的mRNA 水平通過β-actin 校正，實驗數(shù)據(jù)處理采用 2-ΔΔCt法。引物序列見表 1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

5.5 P-gp 抑制劑維拉帕米對滑膜細(xì)胞Rho123 攝取功能的影響 將大鼠滑膜細(xì)胞以每孔約1×105的細(xì)胞數(shù)接種于24孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待大鼠滑膜細(xì)胞形成致密單層，進(jìn)行細(xì)胞攝取實驗。小心吸出24 孔板中培養(yǎng)液，用37 ℃HBSS 潤洗兩遍，將細(xì)胞分為不加抑制劑組、維拉帕米（50μmol/L）組和維拉帕米（100 μmol/L）組，分別加入0.2 mL HBSS、含有維拉帕米（50 μmol/L）的HBSS 和含有維拉帕米（100 μmol/L）的 HBSS；每孔中加入0.5 mL 含有 Rho123（0.25 μmol/L）的 HBSS，隨后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育90 min。小心吸出24 孔板中含藥HBSS，用冰HBSS 潤洗三遍，加入超純水300μL，用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞，使用BCA 試劑盒測定每孔蛋白濃度，并按照5.7 方法測定細(xì)胞懸液中Rho123的濃度。

5.6 MCM 培養(yǎng)對滑膜細(xì)胞Rho123 及MTX 攝取功能的影響 將大鼠滑膜細(xì)胞以每孔約1×105的細(xì)胞數(shù)接種于24孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待大鼠滑膜細(xì)胞至80%匯合度。更換培養(yǎng)液，分為普通 DMEM組和 50% MCM組，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，分別進(jìn)行Rho123 和MTX 細(xì)胞攝取實驗。小心吸出24孔板中培養(yǎng)液，用37 ℃HBSS 潤洗兩遍，每孔中加入0.5 mL 含有 Rho123（0.25 μmol/L）的 HBSS，隨后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育90 min。MTX攝取濃度為100 μg/L，攝取時間60 min。小心吸出 24 孔板中含藥 HBSS，用冰 HBSS 潤洗 3 遍，加入超純水 300 μL，用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞，使用BCA 試劑盒測定每孔蛋白濃度，并按照5.7 方法測定細(xì)胞懸液中Rho123 的濃度，5.8 方法測定細(xì)胞懸液中MTX 的濃度。

5.7 HPLC-RF 法測定Rho123 濃度 色譜條件：YMC C18 色譜柱（規(guī)格為150 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相：水相（A 相）為含0.9%乙酸的10 mmol/L 乙酸銨溶液，有機(jī)相（B 相）為乙腈（40∶60）。流動相流速：1 mL/min；熒光檢測器激發(fā)波長Ex=485 nm，發(fā)射波長Em=546 nm；樣品處理：100 μL 細(xì)胞懸液，加入300 μL 甲醇，振蕩 10 min，21 000×g離心 10 min，取200μL上清液，進(jìn)樣體積為20μL。線性范圍：0.78~100μg/L。

5.8 HPLC-MS 法測定MTX 濃度 色譜條件：Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（3.5μm，2.1×150 mm）；流動相：水相（A 相）為0.1%甲酸-水溶液，有機(jī)相（B相）為乙腈（15∶85）。流動相流速：0.2 mL/min；質(zhì)譜檢測參數(shù)：氣動輔助電噴霧離子化（electro-spray ionization，ESI）；正離子（Positive）檢測；精選離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM）：MTX［M+H］+：m/z 455.0；茶堿［M+H］+：m/z 181.0；加熱塊溫度：400 ℃；DL 管溫度：250 ℃；干燥氣流速：15.0 L/min；霧化器流速：3 L/min。樣品處理：100μL 細(xì)胞懸液，加入10 μL 茶堿（200 μg/L），再加入300 μL 甲醇，振蕩 10 min，21 000×g離心 10 min，取 250 μL 上清液，氮?dú)庀聯(lián)]干，80 μL 復(fù)溶，進(jìn)樣體積：5 μL。線性范圍：0.78~100μg/L。

5.9 Western blot 根據(jù)RIPA 裂解液說明書提取滑膜組織或細(xì)胞樣品蛋白，BCA 檢測蛋白濃度，隨后100 ℃煮沸10 min 進(jìn)行蛋白變性。上樣后進(jìn)行SDSPAGE（80 V 30 min，120 V 90 min）、濕轉(zhuǎn)（P-gp：300 mA 3 h；β-actin：200 mA 90 min），5%脫脂牛奶封閉1 h，分別過夜4 ℃孵育P-gp和β-actin抗體，次日孵育Ⅱ抗。ECL 化學(xué)發(fā)光，暗室顯定影。P-gp 的相對表達(dá)量=P-gp灰度值/β-actin灰度值×100%。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較方差齊時選擇LSD-t檢驗，方差不齊時選擇Dunnett T3 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CIA模型的建立

首次免疫后，第21 天開始造模組大鼠體重顯著低于對照組（P＜0.01；圖1A），第18 天開始造模大鼠逐漸出現(xiàn)足爪腫脹（圖1B），第21及23天造模大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.01；圖1C），提示造模成功。造模前后大鼠踝關(guān)節(jié)到趾骨形態(tài)變化見圖1D。

2 CIA大鼠滑膜P-gp表達(dá)變化

Western blot 檢測CIA 大鼠滑膜P-gp蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，CIA組大鼠滑膜P-gp 表達(dá)與對照組相比顯著降低（P＜0.01），約為對照組的22%，見圖2。

3 MCM對大鼠滑膜細(xì)胞P-gp表達(dá)及功能的影響

3.1 原代滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 分離得到的滑膜細(xì)胞在36 h 后開始貼壁（圖3A），細(xì)胞形態(tài)為梭形、纖維樣，4 d觀察到成簇的細(xì)胞（圖3B），之后逐漸鋪滿瓶底，10 d左右初代細(xì)胞長至匯合（圖3C），傳代細(xì)胞3 d左右可再次傳代。經(jīng)免疫熒光鑒定，滑膜細(xì)胞胞質(zhì)vimentin 表達(dá)呈陽性（圖4），提示原代培養(yǎng)成功，且純度較高（＞98%），可用于后續(xù)的實驗。

3.2 維拉帕米對大鼠原代滑膜細(xì)胞攝取Rho123 功能的影響 細(xì)胞攝取實驗顯示，與不加抑制劑組相比，維拉帕米（50 μmol/L）和維拉帕米（100 μmol/L）組大鼠滑膜細(xì)胞內(nèi)Rho123 的濃度顯著升高（P＜0.01），見圖5。這一結(jié)果表明，原代培養(yǎng)的大鼠滑膜細(xì)胞上P-gp具有外排功能，當(dāng)P-gp功能被抑制時，細(xì)胞內(nèi)Rho123的濃度顯著升高。

3.3 MCM 對大鼠滑膜細(xì)胞P-gp 表達(dá)及功能的影響 50% MCM 與DMEM 分別培養(yǎng)滑膜細(xì)胞24 h，再進(jìn)行Rho123及MTX 攝取實驗。結(jié)果顯示，與DMEM組相比，50% MCM組 Rho123 攝取顯著增加（P＜0.01），MTX攝取亦顯著增加（P＜0.05），見圖6A、B。

Figure 1. Comparison of body weight（A），left hindfoot thickness（B），arthritis index（C）and morphological changes from ankle joint to phalanx in rats（D）between CIA group and control group. Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖1 CIA組和對照組大鼠體重、左后足厚度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足腫脹形態(tài)學(xué)比較

Figure 2. Expression of P-gp in synovium of CIA and control rats. The expression of P-gp protein was analyzed by Western blot.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖2 CIA與對照組大鼠滑膜P-gp的表達(dá)

Figure 3. Culture of primary rat synoviocytes. After separation，the primary synovial cells began to adhere to the wall after 36 h（A），and was fusiform and fibrous. Clusters of cells were observed on day 4（B），and then gradually covered the flat bottom.The primary cells grew to confluence on about day 10（C）. The scale bar=200μm.圖3 原代大鼠滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)

Figure 4. Identification of primary synovial cells. Immunofluorescence staining of vimentin. The scale bar=50μm.圖4 原代滑膜細(xì)胞的鑒定

Figure 5. Rhodamine 123（Rho123）uptake in rat synoviocytes treated with or without P-gp inhibitor verapamil at 50 or 100 μmol/L. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖5 維拉帕米對大鼠原代滑膜細(xì)胞攝取羅丹明123 功能的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與 DMEM組相比，50%MCM組P-gp 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖6C）。RT-qPCR結(jié)果顯示，50%MCM組Mdr1amRNA水平較DMEM組顯著降低（P＜0.01），約為DMEM組的52%，而兩組Mdr1bmRNA 水平無顯著差異，見圖6D。

討 論

滑膜組織持續(xù)的慢性炎癥是推動RA 發(fā)展的直接原因，RA 與免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 等密切相關(guān)［15］，在大量的炎癥細(xì)胞因子釋放的同時，機(jī)體藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和活性也會發(fā)生改變［16］。相關(guān)研究顯示，炎癥狀態(tài)下，外排轉(zhuǎn)運(yùn)體會受到調(diào)控，其表達(dá)有組織依賴性。在大鼠注射佐劑7 和21 d 后，分別測定大鼠肝、腎、小腸和腦中轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp、Mrp2 和Bcrp 蛋白及相關(guān)基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝中Mdr1基因和P-gp 蛋白表達(dá)均下調(diào)，腎中Mdr1基因和P-gp 蛋白表達(dá)均上調(diào)；肝中Mrp2 蛋白表達(dá)下調(diào)，腎中Mrp2 蛋白表達(dá)上調(diào)；肝中Bcrp 蛋白表達(dá)下調(diào)，腎中 Bcrp 蛋白表達(dá)上調(diào)［17］；在CIA 模型中，小鼠肝臟P-gp、Mrp3和Bcrp 蛋白表達(dá)均下調(diào)［18］。外翻腸囊實驗顯示，佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠小腸P-gp 功能是正常大鼠的60%，Mdr1mRNA 和P-gp 蛋白表達(dá)減少［19］。為研究 RA 狀態(tài)下滑膜組織P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和功能的變化，本實驗成功建立了CIA 大鼠模型，在體實驗結(jié)果顯示RA 大鼠滑膜P-gp的表達(dá)顯著低于正常大鼠，可能會影響P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能和其底物在滑膜組織的吸收和分布。

有效抑制滑膜炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療目標(biāo)之一，正?；そM織主要由成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）和巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（macrophage-like synoviocytes，MLS）組成。FLS數(shù)量占所有滑膜細(xì)胞的2/3，是滑膜組織的主要功能細(xì)胞。FLS在生理狀態(tài)下參與了骨關(guān)節(jié)的潤滑、免疫調(diào)節(jié)和維持關(guān)節(jié)腔的穩(wěn)態(tài)；病理狀態(tài)下參與了RA 的發(fā)生、發(fā)展，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥。炎癥狀態(tài)下FLS 的異常增殖和侵襲，是RA 發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，研究顯示，炎性關(guān)節(jié)病狀態(tài)下IL-1β 能活化FLS，使其產(chǎn)生與炎癥相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1 和MMP-13［20］。另外，IL-1β 通過上調(diào) FLS 中的環(huán)加氧酶 2 誘導(dǎo)前列腺素E2的產(chǎn)生來影響RA 等炎性關(guān)節(jié)病的病理過程［21］。FLS 被激活后，IL、干擾素、TNF、集落刺激因子、生長因子和趨化因子等細(xì)胞因子應(yīng)運(yùn)而生，NF-κB 通路作為炎癥的主要通路，參與了RA 等炎癥反應(yīng)的各個階段［22］。RA 病程到一定階段，F(xiàn)LS 具有過異常表達(dá)生長因子的作用［23-24］。這些生長因子使FLS 有絲分裂過度，導(dǎo)致FLS 增生和肥大，影響滑膜新生血管形成和加重病情發(fā)展。可見FLS 在RA 病理過程中扮演著重要角色，是治療RA 等炎性關(guān)節(jié)病的一個新靶點(diǎn)。本實驗在體外建立大鼠滑膜原代培養(yǎng)技術(shù)并培養(yǎng)了大鼠滑膜原代細(xì)胞，采用MCM 模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境，研究炎癥狀態(tài)下大鼠滑膜細(xì)胞P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和功能的變化。結(jié)果顯示，炎癥微環(huán)境下，大鼠滑膜細(xì)胞P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)顯著降低，驗證了在體動物實驗的結(jié)果；同時，炎癥狀態(tài)下大鼠滑膜細(xì)胞對P-gp底物的吸收和分布與正常細(xì)胞相比具有顯著差異，提示炎癥微環(huán)境影響了滑膜細(xì)胞P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和功能，可能會對一些用于RA 治療的藥物在滑膜組織的藥物代謝動力學(xué)行為產(chǎn)生影響，其臨床意義值得進(jìn)一步關(guān)注。

Figure 6. Effects of macrophage-conditioned medium（MCM）on P-gp expression and function in rat synovial cells. A：effect of 50%MCM pretreatment for 24 h on Rho123 uptake in rat synoviocytes；B：effect of 50%MCM pretreatment for 24 h on MTX uptake in rat synoviocytes；C：effect of pretreatment with 50%MCM for 24 h on P-gp expression in rat synoviocytes；D：effect of pretreatment with 50% MCM for 24 h on Mdr1a and Mdr1b mRNA levels in rat synoviocytes. Mean±SD. n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMEM group.圖6 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液對大鼠原代滑膜細(xì)胞P-gp表達(dá)及功能的影響

綜上所述，RA 狀態(tài)下大鼠滑膜細(xì)胞P-gp 表達(dá)及功能顯著降低，可能與滑膜炎癥有關(guān)。目前炎癥狀態(tài)下轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控機(jī)制并不十分明確，實驗結(jié)果顯示炎癥條件下大鼠滑膜細(xì)胞Mdr1a基因表達(dá)水平顯著降低，其機(jī)制可能與炎癥狀態(tài)下大鼠滑膜細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變?nèi)鏒NA 甲基化、組蛋白修飾和微小RNA表達(dá)等有關(guān)，有待進(jìn)一步開展研究。