毛 欽， 馬璐瑤， 劉天怡， 周 娜， 劉夢華， 吳 珺， 郝 鈺

（北京中醫(yī)藥大學生命科學學院免疫與微生物學系，北京 102488）

流感病毒性肺炎是由流感病毒引起的一種急性呼吸道感染，會引發(fā)機體過度的免疫反應和炎癥風暴，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）也具有這一特點［1］。但目前西醫(yī)在治療病毒性肺炎方面未有特效藥，而中醫(yī)藥在治療病毒性肺炎方面具有獨特的優(yōu)勢。

犀角地黃湯合銀翹散（Xijiao-Dihuang decoction combined with Yinqiao powder，XDY）最早見于吳鞠通的《溫病條辨·上焦篇》，銀翹散清熱解毒解表，主治風熱犯表證；犀角地黃湯清熱解毒涼血，主治熱入營血證，二者合用，既能清衛(wèi)分之熱，亦能解營血之毒，達到清熱涼血，解毒化瘀之功效，是“截斷療法”的代表方，可在臨床上用于治療流感病毒性肺炎［2］。本課題組實驗結果表明，XDY 對流感病毒感染的小鼠肺部炎癥有著顯著的治療效果，可以減輕流感病毒感染小鼠的肺組織炎癥病變，降低感染小鼠的死亡率［3］。

巨噬細胞是流感病毒感染過程中炎癥反應的重要效應細胞。流感病毒侵入機體后，除感染肺泡上皮細胞外，還能被肺泡巨噬細胞識別，誘導巨噬細胞產生細胞因子和趨化因子，從而導致炎癥細胞從血管內滲出并遷移至炎癥病灶，繼而釋放大量的炎癥因子與趨化因子，這種級聯(lián)反應被稱為“細胞因子風暴”，也是病毒性肺炎致死的主要原因［4］。流感病毒侵入機體后感染巨噬細胞，使細胞線粒體受到損傷，釋放大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），即線粒體ROS（mitochondrial ROS，mtROS），ROS 參與激活許多炎癥通路，包括炎性體通路。釋放的mtROS 刺激炎性體的激活，促進大量炎癥因子，如白細胞介素（interleukin-1β，IL-1β）等的分泌，引發(fā)炎癥反應［5］。前期研究已經證明XDY 可以清除線粒體損傷產生的ROS，抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體活化，并減少了細胞焦亡的發(fā)生［6］，但如何清除mtROS 的機制還不清楚。細胞自噬能清除損傷的線粒體，減少mtROS 產生［7］。因此，本研究以流感病毒感染的小鼠巨噬細胞為模型，以細胞自噬為切入點，探究XDY 對自噬調節(jié)的流感病毒感染的小鼠巨噬細胞mtROS 水平的影響，為闡明其抗流感病毒誘導的炎癥反應的細胞和分子機制提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

小鼠巨噬細胞系J774A.1 購自北京協(xié)和醫(yī)學院細胞庫。流感病毒鼠肺適應株［A/PR/8/34（/H1N1），PR8］由本教研室液氮保存。XDY（水牛角30 g、生地30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹葉4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g 和牛蒡子9 g）購自北京同仁堂藥店，制成水煎劑，煎藥后制備成凍干粉，每100 g 生藥提取14.53 g 凍干粉。

2 主要試劑

抗微管相關蛋白1 輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）抗體、抗 P62/SQSTM1 抗體和JC-1 法線粒體膜電位檢測試劑盒均購自Solarbio；山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 均購自Abcam；MitoTracker Red CMXRos 和 MitoSOX 染色液均購自Invitrogen；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自 Selleckchem；Mito-TEMPO｛［2-（2，2，6，6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-ylamino）-2-oxoethyl］triphenylphosphonium chloride｝均購自 Sigma；DMEM 培養(yǎng)液購自Corning；胎牛血清購自HyClone。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細胞J774A. 1 接種于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 XDY 對J774A. 1 巨噬細胞的最大無毒濃度測定 用細胞刮刀將處于對數(shù)期生長的細胞刮下，PBS洗滌離心，用DMEM重懸調整細胞濃度至1×108/L并加入96 孔板中（每孔100 μL），設正常組（正常培養(yǎng)不予以刺激）、不同濃度（2 500、1 250、625、312.5 和156.25 mg/L）的細胞加藥組、空白加藥組（無細胞培養(yǎng)液）及調零組（無細胞培養(yǎng)液），每組6 個復孔。細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，每孔加 DMSO 150 μL，避光震蕩 10 min，用酶標儀測定490 nm 與570 nm 的吸光度（A）。分析不同濃度XDY 對細胞活力的影響，細胞生長抑制率≤10%的藥物濃度作為藥物的最大無毒濃度。細胞生長抑制率（%）=［（正常組A值-調零組A值）-（細胞加藥組A值-空白加藥組A值）］/（正常組A值-調零組A值）×100%

3.3 Western blot 檢測小鼠巨噬細胞自噬水平 將小鼠巨噬細胞J774A. 1 接種到6 孔板中，每孔約1×106個細胞。實驗設置正常組（正常培養(yǎng)不予以刺激）、模型組（PR8 感染24 h）、XDY 干預組（PR8 感染及XDY 干預24 h），3-MA（自噬抑制劑）干預（PR8+3-MA）組（3-MA 預處理3 h 后直接加PR8，繼續(xù)培養(yǎng)24 h）、3-MA 對照組（3-MA 預處理 3 h 后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h）及 PR8+3-MA+XDY組（3-MA 預處理 3 h 后直接加PR8 和 XDY，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h），每組 3 個復孔。PR8 感染量為 100 TCID50，XDY 終濃度為 162.5 mg/L，3-MA 終濃度為 5 mmol/L。PR8 感染 24 h 后，收集各組巨噬細胞，加入裂解液裂解提取蛋白，BCA 法進行蛋白定量。蛋白變性后進行SDS-PAGE，電轉條件100 V、70 min，轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉 1 h，加入兔源抗LC3B 抗體（1∶1 000）、兔源抗P62 抗體（1∶1 000）和鼠源抗β-actin 抗體（1∶1 000），室溫搖床孵育3 h。TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min，加入相應的羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）和羊抗鼠Ⅱ抗（1∶5 000），室溫搖床孵育1 h，使用發(fā)光液進行曝光。以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值進行半定量分析。

3.4 免疫熒光檢測線粒體膜電位及線粒體與自噬體共定位情況 將巨噬細胞J774A.1 接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，每個皿約2×106個細胞。設置正常組、模型組和 XDY 干預組。PR8 感染 24 h 后，PBS 清洗細胞2 次，加入JC-1 工作液，37 ℃，5%CO2孵育 20 min，加入 Incubation Buffer 洗 2 次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體膜電位情況。棄培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次（每次3 min），加入染料MitoTracker Red（終濃度100 nmol/L）工作液37 ℃、5%CO2孵育20 min。棄去染料，PBS 洗3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗 3 次，加入 0.3%TritonX-100 處理細胞 15 min（室溫透化），PBS 洗3 次，山羊血清37 ℃封閉1 h（每皿1 mL），棄封閉液，加入兔抗LC3B 抗體工作液（山羊血清1∶150），37 ℃孵育3 h，PBS洗3次，加入羊抗兔Ⅱ抗（山羊血清1∶300），37 ℃孵育1 h，PBS 洗3次。加入DAPI 進行細胞核染色室溫孵育10 min，PBS 洗3 次，加入1 mL PBS，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體（紅色）與LC3（綠色）的共定位情況。

3.5 流式細胞術檢測小鼠巨噬細胞的mtROS 水平 將小鼠巨噬細胞J774A.1接種到6孔板中，每孔約1×106個細胞。設置正常組、模型組、XDY 干預組、Mito-TEMPO（線粒體特異性抗氧化劑）干預（PR8 感染及 500 μmol/L Mito-TEMPO 干預 24 h）組、Mito-TEMPO 對照組（500 μmol/L Mito-TEMPO 干預24 h），3-MA 干預組、3-MA 對照組及 PR8+3-MA+XDY組。病毒感染24 h 后，棄上清，DMEM 清洗細胞一次，加入MitoSOX 工作液，收集各組巨噬細胞，153.166×g離心5 min，加入PBS，用流式細胞儀檢測各組細胞mtROS含量。

3.6 ELISA 檢測小鼠巨噬細胞IL-1β 分泌水平 將小鼠巨噬細胞J774A. 1 接種到6 孔板中，每孔約1×106個細胞。設置正常組、模型組、XDY干預組、3-MA干預組、3-MA 對照組及PR8+3-MA+XDY組，每組3個復孔。病毒感染24 h 后，收集細胞上清液，參照ELISA 試劑盒說明書分別測定各孔細胞上清液中炎癥因子IL-1β的水平。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩組間比較用SNK-q法（方差齊）或Games-Howell 法（方差不齊）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。每組實驗獨立重復3次。

結 果

1 XDY對小鼠巨噬細胞J774A.1的最大無毒濃度

按照細胞生長抑制率的公式計算得出，當XDY的濃度分別為2 500 mg/L、1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L及156.25 mg/L時J774A.1巨噬細胞的抑制率分別為85.77%、11.6%、3.88%、-15.79%和-9.09%。XDY 對J774A. 1 巨噬細胞的最大無毒濃度為650 mg/L。之后根據MTT得出的最大無毒濃度進行預實驗并確定162.5 mg/L作為最佳藥物干預劑量。

2 XDY 對流感病毒感染的小鼠巨噬細胞自噬水平的影響

Western blot檢測顯示，與正常組相比，流感病毒感染的巨噬細胞中LC3-II 和P62 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），3-MA 對照組 LC3-II 蛋白水平顯著降低，P62 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，PR8+XDY組中 LC3-II 和 P62 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；同時，與 PR8+XDY組相比，PR3+3-MA+XDY組LC3-II蛋白水平顯著降低，P62蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與 PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組細胞P62 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effects of XDY on the protein expression of LC3（A）and P62（B）in J774A. 1 cells infected with influenza virus. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PR8 group；△P＜0.05 vs PR8+3-MA group.圖1 XDY對流感病毒感染的巨噬細胞LC3和P62水平的影響

3 XDY 對流感病毒感染的小鼠巨噬細胞內線粒體與自噬體共定位的影響

免疫熒光檢測顯示，與正常組相比，流感病毒感染的巨噬細胞中LC3 熒光信號（綠色）顯著增強，線粒體熒光信號（紅色）顯著減弱（P＜0.01）；PR8+XDY組LC3 熒光信號（綠色）相對于正常組增強，但相對于模型組減弱，線粒體熒光信號（紅色）相對于模型組顯著增強（P＜0.01），可見明顯的共定位情況，見圖2。

4 XDY 對流感病毒感染的小鼠巨噬細胞線粒體膜電位的影響

免疫熒光檢測顯示，正常組JC-1呈現(xiàn)紅色熒光；與正常組相比，模型組紅光強度明顯減弱，胞質內綠光明顯增多；與模型組相比，PR8+XDY組紅光明顯增強，綠光強度減弱，見圖3。

5 XDY 對流感病毒感染的小鼠巨噬細胞mtROS水平的影響

流式細胞術結果顯示，與正常組相比，流感病毒感染的巨噬細胞mtROS 水平顯著升高；與模型組相比，PR8+XDY組和 PR8+Mito-TEMPO組 mtROS 水平顯著降低（P＜0.01）；與 PR8+XDY組相比，PR8+3-MA+XDY組細胞mtROS 水平顯著升高（P＜0.01）；與PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組 mtROS 水平有所降低，但是效果弱于PR8+XDY組，差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

5 XDY 對流感病毒感染的小鼠巨噬細胞IL-1β 水平的影響

ELISA 結果顯示，與正常組相比，模型組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，PR8+XDY組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 水平下降（P＜0.05）；與PR8+XDY組相比，PR8+3-MA+XDY組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 水平有所下降，但效果弱于PR8+XDY組，見圖5。

討 論

Figure 2. Effects of XDY on the colocalization of autophagosome and mitochondria in macrophages infected with influenza virus. Detection of the subcellular location of autophagosome and mitochondria was performed by labeling with the anti-LC3B and MitoTracker Red CMXRos in J774A.1 cells observed under confocal fluorescence microscope. Scale bar=10 μm. Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PR8 group.圖2 XDY對流感病毒感染的巨噬細胞內線粒體與自噬體共定位的影響

自噬是所有真核生物中保守的細胞過程，可降解功能失調的細胞器或大細胞溶質分子，其中包括受損的線粒體［8］。自噬過程分為 4 個階段：（1）雙層隔離膜形成；（2）自噬體形成；（3）自噬溶酶體形成；（4）自噬體溶酶體降解［9］。LC3是自噬體膜上的標志性蛋白，LC3-II 已被證明是自噬體標志物，其水平通常被用來表示自噬體的數(shù)量［10］；P62/SQSTM-1 是一種多功能蛋白，在自噬溶酶體中被降解，其水平代表了自噬通量，即完整的自噬流［11］。流感病毒感染細胞后增加自噬體的產生，但是抑制自噬溶酶體的降解［12］。在本研究中，流感病毒感染小鼠巨噬細胞后，LC3 和P62 的表達量顯著增多，加入自噬抑制劑3-MA 后，與模型組相比，PR8+3-MA組的 P62的表達量增多，說明流感病毒可誘導自噬發(fā)生，但是阻止了完整的自噬流，模型組LC3-II 的增多很有可能是由于自噬體無法與溶酶體融合，導致其無法被降解而堆積；加入 XDY 后，LC3-II 和 P62 的表達量降低，加入自噬抑制劑3-MA 后，與PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組 LC3-II 和 P62 蛋白表達量降低，說明XDY 可以促進形成完整自噬流，其LC3-II 蛋白表達水平低于模型組細胞可能與其促進自噬體與溶酶體融合導致自噬體降解有關。

Figure 3. Effects of XDY on the mitochondrial membrane potential in macrophages infected with influenza virus. Scale bar=10μm.圖3 XDY對流感病毒感染的巨噬細胞線粒體膜電位的影響

Figure 4. Effects of XDY on the levels of mtROS in macrophages infected with influenza virus. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PR8 group；△△P＜0.01 vs PR8+XDY group.圖4 XDY對流感病毒感染的巨噬細胞mtROS水平的影響

流感病毒感染細胞后，會損害線粒體，線粒體膜通透性增加，向細胞質釋放大量的ROS，繼而引發(fā)炎癥［13］。自噬系統(tǒng)可以靶向受損的線粒體并將它們遞送至溶酶體進行降解，這種選擇性的自噬降解線粒體，稱為線粒體自噬［14］。本研究結果顯示，模型組的LC3 表達顯著強于正常組，線粒體熒光信號明顯弱于正常組；PR8+XDY組LC3 表達強于正常組，但較弱于模型組，線粒體熒光信號顯著強于模型組，且有明顯的LC3 與線粒體共定位情況。這些結果表明，流感病毒能導致細胞的線粒體損傷，并且可以促進小鼠巨噬細胞自噬體的生成，但未見明顯的線粒體自噬發(fā)生；XDY 可促進線粒體自噬發(fā)生，減輕線粒體損傷。

檢測線粒體膜電位可以觀察到線粒體的健康情況。JC-1 是一種陽離子脂質熒光染料，可作為檢測線粒體跨膜電位指示劑，有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)。正常健康線粒體的膜電位具有極性，JC-1 形成多聚體發(fā)射紅色熒光；線粒體膜電位去極化時，紅光強度減弱，以單體形式存在于胞質內發(fā)綠色熒光［15］。在本研究中，正常組呈紅色熒光，模型組紅色熒光減弱，胞質中綠色熒光顯著增強，加入XDY 后，紅色熒光增強，綠色熒光減弱，表明流感病毒感染巨噬細胞會導致線粒體跨膜電位去極化，導致線粒體損傷，XDY 可以減輕流感病毒感染小鼠巨噬細胞造成的線粒體損傷。

自噬與mtROS 密切相關。ROS 是一種高活性分子，在未受到刺激的情況下可以平衡細胞穩(wěn)態(tài)，但是過量的ROS 會引起機體代謝紊亂、炎癥性疾病的發(fā)生［16］。線粒體是ROS 產生的主要來源，線粒體氧化磷酸化合成 ATP，ROS 作為其副產物產生［17］。線粒體自噬可以清除損傷的線粒體，減少過多ROS 的產生［18］。在本研究中，流感病毒感染的小鼠巨噬細胞mtROS水平明顯升高，加入XDY后，mtROS水平顯著降低。作為陽性對照，Mito-TEMPO 是一種線粒體靶向超氧化物歧化酶，可以清除mtROS。本研究結果顯示，XDY 和Mito-TEMPO 均可降低流感病毒感染的巨噬細胞內mtROS 水平。加入自噬抑制劑3-MA 以觀察自噬與mtROS 之間的關系，結果顯示，PR8+3-MA+XDY組細胞 mtROS 水平相對于 PR8+XDY組顯著升高，表明抑制細胞自噬可加重細胞mtROS累積，加入自噬抑制劑后XDY 降低mtROS 水平的作用受到抑制，說明XDY 減少mtROS 的作用與促進細胞自噬相關。

ROS 參與激活許多炎癥通路，產生大量促炎細胞因子［19］。本研究顯示XDY 可降低流感病毒感染的巨噬細胞產生白細胞介素的水平，加入自噬抑制劑 3-MA 后，XDY 抑制 IL-1β 的作用減弱，說明 XDY抑制IL-1β的作用與促進細胞自噬相關。

綜上所述，流感病毒感染的小鼠巨噬細胞線粒體受到損傷，產生大量的mtROS，并誘導炎性因子IL-1β的產生；XDY 可以通過促進細胞自噬清除受損的線粒體，減少mtROS的產生，從而抑制ROS參與激活的炎癥通路，減少炎癥因子產生。本研究進一步完善了XDY 干預流感病毒感染的小鼠巨噬細胞mtROS 產生的相關細胞和分子機制，以及XDY 抑制流感病毒引起的小鼠巨噬細胞炎癥反應的部分分子機制，為闡明其抗炎機制提供了實驗依據。