劉夢珂， 郭瀟瀟， 職玲云， 劉歡歡， 宋景貴

（1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院河南省生物精神病學重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453002；3新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453002）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中常見的發(fā)病類型，其急性期的治療直接影響預(yù)后［1］。目前臨床上雖已有溶栓、取栓等早期缺血再灌注的治療方法可取得一定療效，但仍不可避免部分患者出現(xiàn)嚴重的認知、情感和感覺運動障礙等神經(jīng)功能缺損癥狀［2］。原因可能在于IS 發(fā)生時存在著較為復雜的病理機制，氧化應(yīng)激、能量代謝、炎癥級聯(lián)反應(yīng)和細胞凋亡等多種因素參與其病理過程并導致神經(jīng)不可逆性損傷［3］。

現(xiàn)有研究表明，核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）作為細胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在糖尿病、心腦血管疾病和腫瘤等常見疾病中，可通過激活下游多種效應(yīng)分子影響炎癥刺激、抑制氧化應(yīng)激，阻止細胞、組織受到損傷［4］。且Guo等［5］在大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中顯示上調(diào)Nrf2 表達可改善腦組織缺血再灌注引起的神經(jīng)缺損癥狀。此外，相關(guān)研究證明一種人工合成三萜類化合物衍生物CDDO-imidazolide（CDDO-Im）可作為Nrf2 的有效激活劑，促進細胞Nrf2 蛋白表達進而誘導其下游保護性分子發(fā)揮作用［6］。因此，本項工作擬建立腦卒中大鼠模型，并尾靜脈注射CDDO-Im 進行干預(yù)，探究CDDO-Im激活Nrf2信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷修復的影響及作用機制。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級 SD 雄性大鼠 63只，6 周，體重 180~220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCX（京）2016-0006。

2 主要試劑

CDDO-Im 購自 MedChemExpress；尼氏染色液、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；核質(zhì)分離試劑盒（Thermo Fisher）；抗Nrf2、突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）和突觸素（synaptophysin，SYP）抗體（Abcam）；抗血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、Bcl-2 和 Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體（Bioss）；抗GAPDH 和Histone H3抗體（Proteintech）；抗β-actin 抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG Ⅱ抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

3 主要儀器

凝膠電泳及轉(zhuǎn)移裝置（Bio-Rad）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；組織研磨器（武漢新縱科生物技術(shù)有限公司）；酶標儀、超低溫冰箱（Thermo Fisher）；冰凍切片機、烤片機（Leica）；電子精密天平（上海精天電子儀器有限公司）；電鼓風干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon）。

4 方法

4.1 造模與分組 實驗大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)1 周，小動物行為采集和分析系統(tǒng)初步檢測其基本行為特性，從中篩選出評分均一的大鼠，隨機分為3組：假手術(shù)（sham）組、卒中組（MCAO組）和Nrf2 激動劑干預(yù)組（MCAO+CDDO-Im組），每組 21只。MCAO組和MCAO+CDDO-Im組大鼠參考相關(guān)文獻［7］，行 MCAO手術(shù)制作缺血再灌注動物模型（術(shù)后當日待大鼠麻醉清醒后剔除無明顯神經(jīng)缺損癥狀及癥狀過重瀕死大鼠以保證模型質(zhì)量）；假手術(shù)組采用與手術(shù)組相同部位切開皮膚并分離左側(cè)頸動脈后縫合處理，左側(cè)頸總動脈不予線栓處理。MCAO+CDDO-Im組在卒中手術(shù)模型的基礎(chǔ)上，于術(shù)后開始每日定時定量給予尾靜脈注射Nrf2激動劑CDDO-Im（64μg/300 g，每日2次，間隔12 h，持續(xù)3 d）干預(yù)；而假手術(shù)組和卒中組則以相同的條件注射生理鹽水。

4.2 神經(jīng)功能評定 采用Longa 標準的5 級評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評定［8］。采集大鼠行為特征，觀察MCAO 手術(shù)以及注射CDDO-Im 后大鼠的神經(jīng)功能及行為特征變化。

4.3 腦組織含水量測定 神經(jīng)功能評定后隨機選取各組實驗動物處死取腦，將完整的鼠腦表面血液等拭去，去掉小腦及腦干，將大腦沿中線切開。稱量左側(cè)大腦半球重量（濕重），然后將其烘干至恒重，再次進行稱重（干重），計算各組大鼠腦組織含水量。腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

4.4 尼氏染色 隨機選取各組實驗動物進行多聚甲醛心臟灌注后取腦，固定、脫水后冰凍切片。大鼠腦組織切片行尼氏染色（嚴格按照染色液說明書要求步驟進行），顯微鏡下觀察其左側(cè)大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量等變化情況。

4.5 Western blot 隨機選取各組實驗動物處死后取腦，分離左側(cè)海馬組織，使用RIPA 裂解液提取勻漿蛋白或使用試劑盒對其進行核質(zhì)分離提取胞核蛋白，BCA 法測定各樣品蛋白濃度；而后依次進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉、Ⅰ抗孵育（分別為抗Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、PSD95 和SYP 抗體）、Ⅱ抗孵育（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG）、化學發(fā)光拍照以及ImageJ 軟件測算灰度值，定量分析各組大鼠患側(cè)海馬中的蛋白表達水平。

5 統(tǒng)計學處理

采用ImageJ、GraphPad Prism 8.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析和作圖等處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組之間采用單因素方差分析進行比較，兩兩之間采用LSD-t檢驗進行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能評分結(jié)果

根據(jù)Longa 評分標準對各組大鼠進行神經(jīng)功能評定，結(jié)果顯示與sham組相比，MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，組間差異顯著（P＜0.01），提示MCAO 手術(shù)模擬的缺血性腦卒中大鼠模型造模成功；而與MCAO組相比，給予尾靜脈注射CDDO-Im后，大鼠的神經(jīng)功能評定結(jié)果普遍存在分值顯著降低的情況（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 各組大鼠的神經(jīng)功能評分結(jié)果Table 1. Results of neurological function scores of rats in each group（n=21）

2 腦組織含水量對比結(jié)果

干濕重法測得各組大鼠左側(cè)大腦半球腦組織含水量，結(jié)果顯示與sham組相比，MCAO組大鼠患側(cè)（左側(cè)）大腦半球水腫明顯，腦組織含水量顯著增加（P＜0.01）；經(jīng)尾靜脈注射CDDO-Im 干預(yù)后，大鼠腦組 織 含 水 量 較 MCAO組 顯 著 下 降（P＜0.01），見圖2。

Figure 1. Neurological deficit scores of rats in each group. CDDOIm decreased the neurological deficit score in rats with ischemic stroke. Mean±SD. n=21.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO group.圖1 各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況

Figure 2. Comparative results of water content in the left cerebral hemisphere of rats in each group. CDDO-Im alleviated brain edema in rats with ischemic stroke.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs MCAO group.圖2 各組大鼠左側(cè)大腦半球組織含水量對比

3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果

將尼氏染色處理后的大鼠腦切片置于顯微鏡下，可以觀察到sham組左側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)飽滿，細胞壁完整，數(shù)量豐富且排列密集；而MCAO組的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，部分發(fā)生萎縮變形，細胞層數(shù)明顯減少；MCAO+CDDO-Im組神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)病理改變較MCAO組有所改善，見圖3。

Figure 3. Nissl staining results of neurons in left hippocampal CA1 region of rats in each group.圖3 各組大鼠左側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果

4 神經(jīng)元凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2表達情況

Western blot 檢 測 Bax 和 Bcl-2 的 表 達 情況 ，與sham組相比，MCAO組大鼠左側(cè)海馬組織中Bax 蛋白表達增多，Bcl-2 蛋白表達減少，Bax/Bcl-2 水平顯著升高（P＜0.01）；與MCAO組相比，Nrf2 激動劑CDDO-Im 干預(yù)組大鼠海馬組織Bax 蛋白下調(diào)，Bcl-2 蛋白上調(diào)，Bax/Bcl-2水平顯著降低（P＜0.01），見圖4。

5 突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD95及SYP表達情況

為進一步驗證CDDO-Im 在缺血性腦卒中大鼠模型中對神經(jīng)功能的保護作用，進一步采用Western blot 檢測了突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD95 及SYP 的表達情況。結(jié)果顯示與sham組相比，MCAO組大鼠左側(cè)海馬組織中PSD95 和SYP 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；在給予 CDDO-Im 干預(yù) 3 d 后，PSD95 蛋白表達及SYP 蛋白水平均較MCAO組上調(diào)（P＜0.05），見圖5。

6 Nrf2及其下游保護性分子HO-1的表達情況

Western blot方法檢測各組大鼠左側(cè)海馬組織勻漿中Nrf2 及HO-1 蛋白含量并對其進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO組大鼠海馬中Nrf2蛋白表達具有升高的趨勢，但不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與 MCAO組比較，MCAO+CDDO-Im組大鼠海馬中Nrf2蛋白表達同樣具有升高的趨勢而無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖6A。但與sham組相比，MCAO組大鼠海馬中HO-1蛋白表達顯著增多（P＜0.01）；且與MCAO組相比，MCAO+CDDO-Im組大鼠海馬中HO-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），見圖6C。使用試劑盒對各組大鼠左側(cè)海馬組織進行核質(zhì)分離處理，并用Western blot 檢測各組大鼠左側(cè)海馬組織細胞核內(nèi)Nrf2 蛋白含量，結(jié)果表明與sham組相比，MCAO組大鼠海馬組織中Nrf2 入核增多（P＜0.05），且與MCAO組比較，MCAO+CDDO-Im組大鼠海馬組織中N-Nrf2蛋白進一步增加（P＜0.05），見圖6B。

Figure 4. Protein expression levels of Bax and Bcl-2 in hippocampus of rats in each group. CDDO-Im decreased the levels of Bax/Bcl-2 in hippocampus of rats with ischemic stroke. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs MCAO group.圖4 各組大鼠海馬組織Bax和Bcl-2蛋白的表達

Figure 5. Protein expression levels of PSD95 and SYP in hippocampus of rats in each group. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MCAO group.圖5 各組大鼠海馬組織PSD95及SYP蛋白的表達

Figure 6. Protein expression levels of Nrf2（A），nuclear Nrf2（B）and HO-1（C）in hippocampus of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MCAO group.圖6 各組大鼠海馬組織Nrf2、核內(nèi)Nrf2及HO-1的蛋白水平

討 論

缺血性腦卒中是一種常見的急性腦血液循環(huán)障礙性疾病，指各種原因所致腦內(nèi)局部血液供應(yīng)減少或缺失引起腦組織缺血缺氧性壞死，而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀［9］。其病理機制復雜，臨床上溶栓、取栓等治療雖可挽救部分缺血組織，但嚴格受制于時間窗的要求，亦存在出血性轉(zhuǎn)化及再灌注損傷等風險，無法使絕大多數(shù)患者受益［2］。因此針對缺血性腦卒中病理機制采取相應(yīng)干預(yù)措施阻止或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷的研究至關(guān)重要。

本研究采用MCAO 手術(shù)模擬急性腦血液循環(huán)障礙建立缺血性腦卒中大鼠模型。觀察到造模成功的MCAO 大鼠Longa 評分大多集中在2~3 分，存在如精神萎靡、提尾時病灶對側(cè)前肢屈曲、行走時向健側(cè)轉(zhuǎn)圈或向健側(cè)歪倒等典型的神經(jīng)功能缺損癥狀，同時檢測到其患側(cè)大腦半球組織含水量顯著增加。而CDDO-Im 的干預(yù)使得實驗大鼠無論神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)還是腦組織水腫情況均顯著改善。猜測上述變化可能存在的病理生理機制為CDDO-Im 激活了Nrf2信號通路，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子表達從而抑制了組織缺血缺氧所造成的神經(jīng)元細胞凋亡損傷［10］。在腦缺血損傷中細胞凋亡起著關(guān)鍵作用，是造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機制［11］。在相關(guān)研究中表明調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax 表達水平可有效減少神經(jīng)元凋亡，降低腦缺血再灌注帶來的功能損傷［12-13］。為了驗證猜想，本實驗采用Western blot 檢測了各組大鼠左側(cè)海馬組織中Bcl-2 及Bax 蛋白的表達情況，并用尼氏染色法觀察各組大鼠左側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化。兩項實驗結(jié)果相互印證表明CDDO-Im 通過調(diào)節(jié)Bcl-2 和Bax蛋白表達，減輕了MCAO 手術(shù)后大鼠海馬神經(jīng)元的病理損傷。

另一方面，突觸可塑性的變化也被證明與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系，尤其是在缺血后神經(jīng)功能的損傷修復方面起著重要作用［14］。Wen 等［15］的研究中顯示小檗堿預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液（BBR-BMSC-CM）的抗凋亡作用恢復了氧化損傷的突觸蛋白SYP 和PSD95 的水平挽救了神經(jīng)元突觸功能。且Wang 等［16］在阿爾茨海默病模型中觀察到通過上調(diào)Nrf2蛋白水平亦可增強突觸可塑性。那么CDDO-Im 作為Nrf2 激活劑，并可調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞凋亡，是否能在MCAO 大鼠模型中改善突觸可塑性發(fā)揮神經(jīng)保護作用？在本研究中對此進行了驗證，結(jié)果顯示與sham組相比MCAO組大鼠患側(cè)海馬組織中突觸可塑性相關(guān)標志物PSD95 和SYP 表達水平顯著降低，而MCAO+CDDO-Im組PSD95和SYP 蛋白表達水平呈現(xiàn)回升狀態(tài)，提示CDDO-Im 的干預(yù)改善了缺血性腦卒中后大鼠的神經(jīng)突觸可塑性。

此外，上述結(jié)果分析均基于CDDO-Im 激活了Nrf2 信號通路的前提下展開，事實上CDDO-Im 作為Nrf2 的一種活化劑在離體細胞實驗中激活Nrf2 及其下游分子發(fā)揮保護作用的證據(jù)較多［6，17］，但其于體內(nèi)效用方面的資料卻相對較少。為了證實CDDO-Im在缺血性腦卒中大鼠體內(nèi)激活Nrf2信號通路而表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用，本研究采用Western blot 方法對各組大鼠左側(cè)海馬組織勻漿中Nrf2蛋白進行了定量分析。結(jié)果顯示與MCAO組相比較，CDDO-Im 干預(yù)的MCAO+CDDO-Im組大鼠Nrf2 蛋白表達水平雖有升高趨勢卻并無統(tǒng)計學意義，而這一實驗結(jié)果與我們的預(yù)期并不完全相符?；仡櫼酝嚓P(guān)研究均顯示被氧化應(yīng)激等刺激激活后，Nrf2 蛋白的水平會上調(diào)，但同時值得注意的是，Nrf2 被激活后是與其負調(diào)控蛋白Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-1ike ECH-associated protein l，Keap1）的非活性復合物解離易位入核發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子作用的［18-20］。于是本實驗將各組大鼠患側(cè)海馬組織進行了核質(zhì)分離處理獲得胞核蛋白勻漿，再次對其中Nrf2蛋白進行定量分析，結(jié)果顯示卒中后大鼠患側(cè)海馬組織內(nèi)Nrf2 入核增加，給予尾靜脈注射CDDO-Im 后，其細胞核內(nèi)Nrf2 蛋白水平進一步升高。同時，與sham組相比，MCAO組大鼠海馬組織勻漿中HO-1 蛋白表達顯著上調(diào)，且與MCAO組相比 MCAO+CDDO-Im組 HO-1 水平進一步顯著上升。證明CDDO-Im 可促進缺血性腦卒中大鼠海馬區(qū)Nrf2 的入核，激活Nrf2 信號通路并上調(diào)其下游保護性分子HO-1的蛋白水平。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CDDO-Im 可激活缺血性腦卒中大鼠腦內(nèi)Nrf2 信號通路，減輕缺血再灌注后腦組織水腫、減少海馬神經(jīng)元凋亡并改善神經(jīng)突觸可塑性，從而實現(xiàn)神經(jīng)功能保護作用。