曾 琪， 俞梅琴， 劉艷娟

（1贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院超聲科，江西 贛州 341001；2贛南醫(yī)學院，江西 贛州 341001；3湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學附屬第一醫(yī)院急救醫(yī)學研究所，急危重癥代謝組學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410005）

神經(jīng)退行性疾病是一類大腦和脊髓神經(jīng)元逐漸喪失，導致個體行為和認知能力異常為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。炎癥反應被認為在神經(jīng)退行性疾病過程中起關(guān)鍵作用［2］，而小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)炎癥反應中的重要細胞之一［3］；在神經(jīng)退行性疾病中處于中心地位［4］。小膠質(zhì)細胞受到不同的刺激時會發(fā)生表型和功能的不同分化，稱為小膠質(zhì)細胞極化。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導小膠質(zhì)細胞M1 型極化，分泌促炎因子從而促進神經(jīng)炎癥反應［5］。因此，抑制小膠質(zhì)細胞M1型極化是神經(jīng)退行性疾病防治的重要策略之一。

在機體的免疫炎癥系統(tǒng)中，免疫細胞可通過模式識別受體識別病原相關(guān)分子模式，NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）屬于胞漿型模式識別受體［6］。PYNOD 是 NLRs 家族中首個被發(fā)現(xiàn)的炎癥反應負調(diào)節(jié)成員［7］。作者團隊前期研究證實PYNOD能減輕 LPS 介導的 BV2 小膠質(zhì)細胞炎癥反應［8-9］，但具體機制尚未完全闡明。多種信號通路參與極化的調(diào)控［10］，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路參與不同炎癥反應和促炎因子的表達調(diào)控，被認為對M1型極化具有重要調(diào)控作用；而過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）則對 M2 型極化起促進作用。PYNOD 對神經(jīng)炎癥的負性調(diào)控是否與小膠質(zhì)細胞極化有關(guān)尚不清楚。因此，本研究中采用LPS 體外刺激BV2 小膠質(zhì)細胞，觀察PYNOD 對小膠質(zhì)細胞極化的影響，并探討其可能機制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

BV2 小膠質(zhì)細胞和PYNOD 過表達質(zhì)粒由本室保存；MEM 培養(yǎng)液購自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清購自BI；PBS、胰酶、100×青霉素/鏈霉素購自Biosharp；細胞轉(zhuǎn)染試劑陽離子聚合物Jet-PeiTM購自PolyPlus；LPS 購自Sigma；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 IL-10 ELISA 檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑購自TaKaRa；PYNOD、P65、磷酸化 P65（phosphorylated P65，p-P65）、PPARγ 和GAPDH 抗體以及羊抗兔II 抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；ECL 發(fā)光液和PVDF 膜購自Millipore。酶標儀（BioTek）；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜和化學發(fā)光成像儀（Bio-Rad）。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) BV2 小膠質(zhì)細胞用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。在細胞生長至對數(shù)生長期、融合度為80%左右時進行傳代或接種鋪板操作。

2.2 分組處理 將BV2 小膠質(zhì)細胞分為正常對照（control）組；LPS組：500 μg/L LPS 處理 48 h；空質(zhì)粒對照組［ngeative control（NC）+LPS組］：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h 后，給予500 μg/L LPS 處理48 h；過表達PYNOD組（PYNOD+LPS組）：PYNOD 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，給予500μg/L LPS處理48 h。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和PYNOD 表達 將BV2 細胞以每孔1×106接種至6 孔板，按陽離子聚合物JetPeiTM說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BV2細胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，并采用real-time PCR 和 Western blot 檢 測 PYNOD 的 mRNA和蛋白表達情況。

2.4 Real-time PCR 法檢測 BV2 細胞中 PYNOD、IL-6、TNF-α 和 IL-10 的 mRNA 表達 將 BV2 細胞以每孔1×106接種至6 孔板，依照不同分組進行實驗操作后，用PBS 緩沖液清洗3 次，加入RNA 提取試劑裂解細胞，提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用熒光定量PCR試劑，以GAPDH 作為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法［11］分析 PYNOD、IL-6、TNF-α 和IL-10 的mRNA 表達情況。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

2.5 ELISA 法檢測 BV2 細胞上清中 IL-6、TNF-α 和IL-10的水平 將BV2細胞以每孔1×104接種至96孔板，依照不同分組進行實驗操作后，4 ℃、200×g離心15 min，收集細胞培養(yǎng)液上清至1.5 mL 離心管，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩LISA 操作按試劑盒說明書進行，測定在450 nm 波長下的吸光度，并通過標準曲線對BV2 細胞上清樣本中 IL-6、TNF-α 和 IL-10 的含量進行計算。

2.6 Western blot 法檢測 BV2 細胞中 PYNOD、p-P65和PPARγ 的蛋白表達 將BV2 細胞以每孔1×106接種至6 孔板，依照不同分組進行實驗操作后，用PBS清洗細胞3次，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒對細胞樣本進行蛋白定量后煮沸變性。取30μg總蛋白通過12%的SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入相應Ⅰ抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜。TBS-T 清洗3次后，加入Ⅱ抗（1∶5 000 稀釋）室溫孵育1 h。TBS-T清洗3次后，加入ECL發(fā)光液后成像采集，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析PYNOD和PPARγ等目的蛋白的相對表達情況，以總P65 作為內(nèi)參照，分析p-P65 蛋白水平。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。圖形繪制和統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 8 軟件。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 LPS 介導 BV2 小膠質(zhì)細胞 IL-6、TNF-α 和 IL-10的表達和分泌情況

Real-time PCR 和ELISA 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)500μg/L LPS 處理后，BV2 細胞中 M1 型細胞因子 IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達水平和分泌量較對照組均顯著升高（P＜0.01），M2 型細胞因子 IL-10 的mRNA 表達水平和分泌量也較對照組顯著升高（P＜0.05），見圖1及表2。

Figure 1. Relative mRNA expression of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 LPS介導BV2細胞相關(guān)炎癥因子mRNA的表達情況

表2 LPS介導BV2細胞炎癥因子分泌情況Table 2. Release of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells（ng/L. Mean±SD. n=6）

2 LPS 介導的 BV2 小膠質(zhì)細胞中 p-P65 和 PPARγ的蛋白水平

Western blot 檢測結(jié)果顯示，經(jīng) 500 μg/L LPS 處理后，BV2 細胞M1 型極化的轉(zhuǎn)錄因子p-P65 蛋白水平較對照組顯著升高（P＜0.05），而M2型極化的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ 蛋白表達較對照組顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 BV2細胞PYNOD過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的驗證

Real-time PCR 和 Western blot 檢測結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒對照轉(zhuǎn)染的BV2 細胞相比，PYNOD 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BV2 細胞中PYNOD 的mRNA 和蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），見圖3。這說明PYNOD 過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細胞。

4 PYNOD 過表達對LPS 介導的BV2 小膠質(zhì)細胞中IL-6、TNF-α和IL-10表達和分泌的影響

Figure 2. The protein levels of p-P65 and PPARγ in LPS-mediated BV2 cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 LPS介導的BV2細胞中p-P65和PPARγ的蛋白水平

Figure 3. The mRNA（A）and protein（B）expression of PYNOD in PYNOD overexpression plasmid-transfected BV2 cells. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs NC group.圖3 轉(zhuǎn)染PYNOD過表達質(zhì)粒的BV2細胞中PYNOD的表達情況

Real-time PCR 和ELISA 檢測結(jié)果顯示，與NC+LPS組相比，PYNOD 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BV2 細胞經(jīng)500μg/L LPS處理后M1型細胞因子IL-6和TNF-α的mRNA 水平和細胞上清中含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而 M2 型細胞因子 IL-10 的 mRNA 水平和細胞上清中含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖4及表3。

Figure 4. The mRNA expression of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells after PYNOD overexpression. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NC+LPS group.圖4 PYNOD過表達后LPS介導的BV2細胞炎癥因子的mRNA表達情況

表3 PYNOD過表達后LPS介導BV2細胞炎癥因子釋放情況Table 3. Release of inflammatory factors in LPS-mediated BV2 cells after PYNOD overexpression（ng/L. Mean±SD. n=6）

5 PYNOD 過表達對LPS 介導的BV2 小膠質(zhì)細胞中p-P65和PPARγ蛋白水平的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與NC+LPS組相比，PYNOD 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BV2 細胞經(jīng)500μg/L LPS處理后M1型極化的轉(zhuǎn)錄因子p-P65蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而M2 型極化的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 5. The protein levels of p-P65 and PPARγ in LPS-mediated BV2 cells after PYNOD overexpression. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NC+LPS group.圖5 PYNOD過表達后LPS介導的BV2細胞中p-P65和PPARγ的蛋白水平

討 論

神經(jīng)炎癥被認為在神經(jīng)退行性疾病的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］，其主要病理特征是腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的激活。小膠質(zhì)細胞相當于腦和脊髓中的巨噬細胞，是腦內(nèi)常駐的免疫效應細胞［13］，在維持機體的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)炎癥反應和損傷修復等過程中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細胞在不同的微環(huán)境下極化成促炎的M1 型和抗炎的M2 型，釋放不同類型的細胞因子而發(fā)揮作用［14］。本研究結(jié)果顯示，LPS介導 BV2 小膠質(zhì)細胞 M1 型細胞因子 IL-6 和 TNF-α 及M2 型細胞因子IL-10 的表達和釋放均增加，且M1 型細胞因子增加程度明顯高于M2 型細胞因子。IL-6和TNF-α 的升高表明LPS 促進BV2 小膠質(zhì)細胞炎癥反應，而IL-10 的升高可能是細胞對LPS 刺激后的反饋性升高，發(fā)揮一定的保護作用，與前人報道［15］的結(jié)果一致。

小膠質(zhì)細胞極化受到細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控，不同的轉(zhuǎn)錄因子激活啟動不同基因表達以實現(xiàn)表型特征［16］。NF-κB 和 PPARγ 分別是小膠質(zhì)細胞M1 型和 M2 型極化的特異性轉(zhuǎn)錄因子［17］。NF-κB 是公認的促炎因子，能轉(zhuǎn)錄調(diào)控IL-6 和TNF-α 的表達和釋放，而 PPARγ 能誘導細胞釋放 IL-4 和 IL-13，誘導 M2 型細胞極化［18］。本研究結(jié)果顯示，LPS 介導BV2 小膠質(zhì)細胞 p-P65 高表達，PPARγ 低表達，表明LPS的確促進BV2小膠質(zhì)細胞M1型極化。

NLRs 家族成員之一的NLRP3 作為炎癥小體重要的組成部分［19］，有研究報道其能夠通過小膠質(zhì)細胞 M1 型極化發(fā)揮促炎作用［20］。而 PYNOD 是 NLRs家族中負調(diào)節(jié)炎癥反應成員［21］。我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達PYNOD，發(fā)現(xiàn)PYNOD 高表達后LPS 介導IL-6和TNF-α 表達和釋放受抑制，而IL-10 則進一步升高，表明PYNOD 在神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞中發(fā)揮抗炎作用。而進一步針對轉(zhuǎn)錄因子的研究顯示：PYNOD 能降低 p-P65 活性，升高 PPARγ 表達，提示PYNOD 可能通過影響細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中的轉(zhuǎn)錄因子活性或表達而調(diào)控小膠質(zhì)細胞不同類型的極化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PYNOD 可與ASC 蛋白的PYD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 活性［8］；此外PYNOD 減少IL-1β 的產(chǎn)生，另有研究報道IL-1β能下調(diào) PPARγ 表達［22］，這些可能是 PYNOD 調(diào)控NF-κB和PPARγ的機制。

綜上所述，PYNOD 能夠抑制小膠質(zhì)細胞M1 極化，促進M2極化，其機制可能與降低轉(zhuǎn)錄因子p-P65活性和升高PPARγ 表達活性有關(guān)。我們的研究為PYNOD 發(fā)揮炎癥反應的負調(diào)節(jié)作用和減輕神經(jīng)炎癥等提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。