肖紅艷， 方 芳， 顧 林

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺二科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060）

絕大多數(shù)與乳腺癌相關(guān)的死亡是由于轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，例如肺和骨骼［1］。腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷遺傳和表觀遺傳變化以獲得轉(zhuǎn)移能力［2］。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）是表觀遺傳學(xué)研究最廣泛的一類酶，通過組蛋白上乙?；某练e來修飾染色質(zhì)［3］。重要的是，HAT 酶的調(diào)節(jié)顯著改變了正常的基因表達(dá)，并與包括癌癥在內(nèi)的幾種疾病的發(fā)展有關(guān)［4-5］。盡管在過去幾十年中描述了許多HATs 在基因調(diào)控和腫瘤發(fā)生中的作用，但其中一些酶的功能在很大程度上仍然未知，如N 末端乙?；D(zhuǎn)移酶（N-terminal acetyltransferases，NATs）主要修飾蛋白質(zhì)或多肽的 N 端 α-氨基［6］。N-α-乙酰基轉(zhuǎn)移酶D（N-α-acetyltransferase D，NATD）屬于NATs 家族成員之一，具有GCN5相關(guān)乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族的保守序列基序，使其能專一地介導(dǎo)組蛋白H4和H2A的Nt乙?；?，并在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［7］。最近的一項(xiàng)研究表明，NATD 是侵襲性肝癌亞型潛在預(yù)后標(biāo)志物［8］。此外，NATD 在肝細(xì)胞癌組織中顯示下調(diào)，并且異位NATD 表達(dá)使肝癌細(xì)胞系對(duì)藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感［9］。盡管有上述證據(jù)，NATD在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的NATD 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A2（forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2）表達(dá)以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且該過程涉及腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）發(fā)生。因此，NATD 可能成為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 細(xì)胞

人細(xì)胞系MDA-MB-231 及其對(duì)肺轉(zhuǎn)移衍生物L(fēng)M2-4175（LM2）、MCF10CA1h 及其轉(zhuǎn)移性等基因系MCF10CA1a 均購(gòu)自 ATCC。MDA-MB-231 及 LM2 接種在含有10%胎牛血清（HyClone）和100 mg/L 青霉素/鏈霉素（Gibco）的 DMEM 培養(yǎng)液（HyClone）中生長(zhǎng)。MCF10 系列細(xì)胞系在補(bǔ)充有10 mg/L 胰島素、20 μg/L 表皮生長(zhǎng)因子、0.5 μg/L 氫化可的松、100μg/L 青霉素/鏈霉素和 20% 馬血清（HyClone）的DMEM/F12 培養(yǎng)液（HyClone）中生長(zhǎng)。每周使用第5~8代的細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)試支原體污染。

2 方法

2.1 癌細(xì)胞中蛋白的質(zhì)譜分析 通過刮刀或胰蛋白酶處理收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS 與磷酸酶和蛋白酶抑制劑）在冰上裂解 15 min，然后以 17 000×g離心 15 min。用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。上樣30μg 的蛋白質(zhì)，并在8%~12% SDS-PAGE 分離。每條泳道被切割成12個(gè)部分。將每個(gè)切片切成約1 mm×1 mm×1 mm的立方體，然后將凝膠片在100%乙腈中脫水15 min，通過SpeedVac 完全干燥，在50 μL 含有0.01 μg/μL 胰蛋白酶（Promega）的25 mmol/L 碳酸氫銨（Promega）中溶脹，并在37 ℃下孵育過夜。肽段用含5%甲酸的50%乙腈提取4 次。將所得肽段在MDLC 系統(tǒng)（Michrom Bioresources）與 Thermo Finnigan 2D 線性離子阱質(zhì)譜儀（Thermo）耦合上進(jìn)行納米LCMS/MS實(shí)驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)文件都是通過對(duì)人類國(guó)際蛋白質(zhì)指數(shù)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（IPI. Human. v3.67.fasta）搜索 MS/MS 譜圖創(chuàng)建，使用 BioWorks 3.3 軟件套件中的TurboSEQUEST 程序，前體-離子質(zhì)量容差為2.0 amu，碎片離子質(zhì)量容差為0.8 amu。胰蛋白酶被設(shè)置為蛋白酶，允許有兩個(gè)缺失的切割位點(diǎn)。搜索的肽段和蛋白質(zhì)在Trans-Proteomic Pipeline（TPP）4.2 中使用默認(rèn)參數(shù)通過PeptideProphet1 和ProteinProphet2 進(jìn)行驗(yàn)證。ProteinProphet P 值大于0.9 且具有不少于3 種獨(dú)特肽段的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是真正的鑒定。隨機(jī)IPI.HUMAN.v3.67.fasta 用作數(shù)據(jù)庫(kù)來估計(jì)蛋白質(zhì)識(shí)別的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。在我們的分析中，ProteinProphet 0.9的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜1%。將含有相同肽段的蛋白質(zhì)分組，每組中只剩下一種概率最高的蛋白質(zhì)。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將全長(zhǎng)人NATD 基因克隆到pMSCV 載體（Clontech）中以產(chǎn)生NATD表達(dá)質(zhì)粒。NATDshRNA（sh-NATD）質(zhì)粒購(gòu)自Sigma。所有質(zhì)粒均通過DNA 測(cè)序驗(yàn)證。將MDA-MB-231、LM2 細(xì)胞接種在6 孔板中，生長(zhǎng)至80%~90%匯合度并用X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑（Roche）將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，以進(jìn)行NATD過表達(dá)和敲除。對(duì)于救援實(shí)驗(yàn)，MDA-MB-231細(xì)胞與FOXA2和NATD過表達(dá)質(zhì)粒體共轉(zhuǎn)染48 h，收獲細(xì)胞用于后續(xù)分析。針對(duì)FOXA2過表達(dá)質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 人乳腺癌組織及免疫組化分析 石蠟包埋的原發(fā)腫瘤146 個(gè)從天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院獲得。分別對(duì)其中具有隨訪信息的樣本用于轉(zhuǎn)移（n=96）和具有總生存信息的樣本用于總生存（n=58）的Kaplan-Meier 分析。研究經(jīng)所有受試者的知情同意和醫(yī)院機(jī)構(gòu)的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)研究。將石蠟固定的標(biāo)本切成4μm 厚，并附著在玻片上。然后將腫瘤組織切片在二甲苯中脫蠟并用梯度乙醇脫水。用蒸餾水沖洗后，在室溫下用3.0%過氧化氫阻斷組織過氧化物15 min?？乖跈幟仕峋彌_液中用微波加熱修復(fù)。然后將載玻片冷卻至室溫。用PBS洗滌3次后，用抗NATD 抗體孵育載玻片。通過HRP 連接的Ⅱ抗顯示結(jié)合的Ⅰ抗。在倒置顯微鏡拍攝圖像。根據(jù)腫瘤的染色強(qiáng)度中值將樣本分為NATD 高表達(dá)組和低表達(dá)組并用于生存分析。

2.4 小鼠實(shí)驗(yàn) 從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購(gòu)買了6~8 周齡Balb/c 雌性小鼠。小鼠被麻醉并向尾靜脈注射NATD過表達(dá)或敲除乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231 和 LM2 細(xì)胞：2.5×105）用于肺轉(zhuǎn)移。對(duì)于生物發(fā)光成像（bioluminescence imaging，BLI），通過給小鼠腹腔注射底物D-熒光素（150 mg/kg），然后使用IVIS 光譜儀（PerkinElmer）監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的全身擴(kuò)散，并在不同時(shí)間點(diǎn)使用BLI 測(cè)量了肺部轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)。使用Living Image 2.50 分析BLI 圖像。通過人工繪制肺輪廓對(duì)應(yīng)區(qū)域內(nèi)BLI 信號(hào)的光子通量來測(cè)量肺轉(zhuǎn)移性腫瘤負(fù)擔(dān)。

2.5 微陣列分析技術(shù) 分別使用Affymetrix 人類基因2.0 ST 陣列對(duì)LM2 和MCF10CA1a 進(jìn)行基因表達(dá)微陣列分析，包括或不包括NATD敲除。使用默認(rèn)設(shè)置的R 軟件包“Oligo”對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用魯棒多芯片平均算法（RMA）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。將對(duì)照組和NATD基因敲除組之間表達(dá)水平變化1.5倍或更大（t檢驗(yàn)P＜0.05）的基因定義為差異表達(dá)基因。

2.6 反相蛋白質(zhì)陣列分析 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染NATD敲除的LM2 和MCF10CA1a 的蛋白裂解物連續(xù)稀釋并排列在硝酸纖維素涂層的載玻片上。在上海伯豪生物技術(shù)有限公司對(duì)載玻片上的蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行反相蛋白質(zhì)陣列分析分析。通過標(biāo)準(zhǔn)化log2 轉(zhuǎn)化和以抗體為中心的中值來表示蛋白質(zhì)和磷蛋白的表達(dá)水平。使用Studentt檢驗(yàn)確定對(duì)照組和NATD基因敲除組之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，雙側(cè)P＜0.05。

2.7 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq）研究樣本均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司在Illumina HiSeq 2500 進(jìn)行，單端讀取長(zhǎng)度為50 bp。使用hisat2 將深度測(cè)序數(shù)據(jù)與人類參考基因組版本38（GRCh38）比對(duì)。基因結(jié)構(gòu)注釋通過R 軟件包BioMart 從BioMart 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集hsapiens_Gene_ensembl 中提取。如果相應(yīng)基因具有多個(gè)異構(gòu)體，則使用最長(zhǎng)的異構(gòu)體，并將對(duì)齊的讀取擴(kuò)展到150 bp 以滿足平均片段大小。為了平衡峰值調(diào)用中內(nèi)含子的干擾，我們將基因結(jié)構(gòu)注釋從基于基因組的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換為基于最長(zhǎng)異構(gòu)體的坐標(biāo)。每個(gè)基因每個(gè)窗口的讀取計(jì)數(shù)通過相應(yīng)基因所有窗口的中值讀取計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。RIP富集峰（窗口）通過FDR＜0.05 和富集分?jǐn)?shù)的 log2 轉(zhuǎn)換≥1 確定。通過 Fisher 精確測(cè)試P值調(diào)整FDR，該值評(píng)估RIP和輸入樣本之間的差異窗口。通過（IP_C×Input_MedC）（/IP_MedC×Input_C）計(jì)算窗口富集分?jǐn)?shù)。IP_C：當(dāng)前峰值中RIP樣本的讀取計(jì)數(shù)；IP_MedC：當(dāng)前異構(gòu)體上所有窗口中RIP 樣本的中值讀取計(jì)數(shù)；Input_C：讀取當(dāng)前峰值中輸入樣本的計(jì)數(shù)；Input_MedC：當(dāng)前異構(gòu)體上所有窗口中輸入樣本的中值讀取計(jì)數(shù)。每個(gè)基因中RIP-seq 的標(biāo)準(zhǔn)化分布是每個(gè)亞型中每個(gè)位點(diǎn)的讀取計(jì)數(shù)，通過選取相應(yīng)亞型中所有位點(diǎn)的中值對(duì)讀取計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。

2.8 細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定 在Transwell 室（BD Biosciences）中檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞接種在上室孵育24 h，將滲透到下表面的遷移細(xì)胞固定并用結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich）染色。對(duì)于侵襲測(cè)定，基質(zhì)凝膠預(yù)涂在上室的聚碳酸酯膜上，其他同遷移能力測(cè)定。用BX-60顯微鏡（Olympus）觀察細(xì)胞。

2.9 免疫熒光測(cè)定 MDA-MB-231 細(xì)胞用指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并鋪在室載玻片上。細(xì)胞在3.7%甲醛中固定，并在室溫下用0.15%Triton X-100 滲透。然后洗滌細(xì)胞，用5% BSA 封閉并與抗E-鈣黏蛋白（1∶500，Cell signaling Technology）和抗N-鈣黏蛋白（1∶800，Cell signaling Technology）抗體在4 ℃溫育16 h。然 后 用 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 偶 聯(lián) II 抗（Thermo Fisher Scientific）探測(cè)細(xì)胞，用DAPI 染色并固定在顯微鏡載玻片上。使用Leica 共聚焦系統(tǒng)（Leica）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。

2.10 Western blot 使用RIPA 裂解緩沖液（Abcam）從細(xì)胞中提取總蛋白。將50μg 細(xì)胞裂解物電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（GE Healthcare）。然后封閉膜并用抗NATD（1∶1 000）、FOXA2（1∶800）、E-鈣粘蛋白（1∶2 000）、N-鈣粘蛋白（1∶1 000）、波形蛋白（1：500）和GAPDH（1∶5 000）抗體在4 ℃孵育過夜。洗滌膜并用HRP 偶聯(lián)的Ⅱ抗進(jìn)行探測(cè)。所有抗體均購(gòu)自Abcam。ECL 底物用于觀察印跡。用ImageJ軟件分析相對(duì)條帶強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0 進(jìn)行分析，并表示為至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。組間比較采用雙尾Student＇st檢驗(yàn)，多組間比較采用單向方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier 生存曲線分析乳腺癌中NATD 表達(dá)對(duì)總體存活率、無轉(zhuǎn)移生存的影響，以及NATD過表達(dá)或敲減對(duì)小鼠的無轉(zhuǎn)移生存期的影響，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NATD表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)

質(zhì)譜組學(xué)分析顯示共有30 個(gè)蛋白在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，其中NATD 是受調(diào)控的蛋白質(zhì)之一（圖1A）。此外，Western blot 也證實(shí)了NATD 蛋白在LM2 和MCF10CA1a 轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于MDA-MB-231 和MCF10CA1h 親本腫瘤細(xì)胞（圖1B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NATD 表達(dá)的臨床相關(guān)性，我們通過NATD 免疫組化染色分析了一組人類乳腺腫瘤（圖1C），發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤中較高的NATD 表達(dá)與患者的總生存期縮短（HR=3.673，95% CI=1.611~8.376，P=0.003）和無轉(zhuǎn)移縮短（HR=3.347，95%CI=1.740~6.438，P=0.001）有關(guān)（圖1D、E）。這些結(jié)果表明NATD與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)。

Figure 1. NATD expression was related to breast cancer cell metastasis. A：MS omics analysis heatmap of breast cancer cell lines with different metastatic ability；B：The expression of NATD protein in breast cancer cell lines with different metastatic ability was analyzed by Western blot（I：MDA-MB-231；II：LM2；III：MCF10CA1h；IV：MCF10CA1a）；C：the low expression and high expression of NATD in breast cancer tissues were demonstrated by immunohistochemistry；D：comparison of overall survival rate between high and low expression of NATD in breast cancer（n=58）；E：comparison of metastasis-free survival between high and low expression of NATD in breast cancer（n=96）.圖1 NATD表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)

2 NATD促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

然后我們探討了NATD 在肺轉(zhuǎn)移中的功能作用。分別在MDA-MB-231 細(xì)胞和LM2 細(xì)胞中過表達(dá)或敲減NATD，并通過Western blot 驗(yàn)證（圖2A）。將NATD 過表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，與pMSCV 對(duì)照組相比，NATD 過表達(dá)組顯著加劇了小鼠肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)（圖2B、C）并縮短了動(dòng)物的存活期（圖2D）。相比之下，將NATD敲減的LM2 癌細(xì)胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，減少了小鼠的肺定植并延長(zhǎng)了無轉(zhuǎn)移生存期（圖2E~G）。

Figure 2. NATD promoted lung metastasis of breast cancer. A：overexpression and knockdown of NATD in MDA-MB-231 and LM2 were verified by Western blot. B，C and D：MDA-MB-231 overexpressing NATD was injected intravenously for lung metastasis analysis. B：bioluminescence imaging（BLI）quantification and representative images（n=10）；C：Lung surface nodules quantification and representative images（n=5）；D：animal survival rate（n=8）. E，F(xiàn) and G：intravenous injection of NATD knockdown LM2 for lung metastasis analysis. E：bioluminescence imaging（BLI）quantification and representative images（n=10）；F：lung surface nodules quantification and representative images（n=5）；G：animal survival rate（n=8）.Mean±SD.**P＜0.01 vs pMSCV group；△△P＜0.01 vs sh-NC group.圖2 NATD促進(jìn)乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移

3 通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列和RIP-Seq 分析鑒定NATD靶標(biāo)

為了研究NATD 在轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，我們使用反相蛋白質(zhì)陣列分析了NATD敲減的LM2 和MCF10CA1a 轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)，其涵蓋了主要信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。在分化表達(dá)的蛋白質(zhì)中，有34 個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著改變（22 個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，12個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)）（圖3A）。接下來，在LM2細(xì)胞中進(jìn)行NATD RNA 免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq），并在22 個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)基因（FOXA2、ABL1和MSH6）的mRNA 與NATD 蛋白結(jié)合（圖3B），表明它們是NATD 的直接目標(biāo)。已知FOXA2對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移很重要；其他2 個(gè)基因在轉(zhuǎn)移中的功能目前尚未見報(bào)道。一致地，LM2 和MCF10CA1a 細(xì)胞中的NATD敲減也在體外上調(diào)這些基因的蛋白水平（圖3C）。

4 FOXA2是NATD在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中的必需靶點(diǎn)

為了研究NATD 是否通過調(diào)節(jié)NATD 軸發(fā)揮作用，我們?cè)贛DA-MB-231 細(xì)胞中過表達(dá) NATD 和FOXA2。在NATD 過表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞中，F(xiàn)OXA2 表達(dá)明顯降低（圖4A）。然而，在NATD 過表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞中，F(xiàn)OXA2 過表達(dá)在一定程度下調(diào)NATD 表達(dá)和上調(diào) FOXA2 表達(dá)（圖 4A、B）。NATD 過表達(dá)介導(dǎo)的對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)作用被FOXA2 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖4C、D）。此外，免疫熒光和Western blot 印跡分析顯示，NATD 過表達(dá)介導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞的EMT 過程，而FOXA2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了NATD 對(duì)EMT 過程的誘導(dǎo)作用（圖4E~H）。這些數(shù)據(jù)提示NATD 可能通過調(diào)節(jié)FOXA2來抑制乳腺癌的EMT和轉(zhuǎn)移。

Figure 3. Identification of NATD targets by high-throughput reversed-phase protein array and RIP-Seq analysis. A：supervised hierarchical clustering analysis of the differential expression of 34 proteins identified by the high-throughput reverse-phase protein array between NATD knockdown LM2 and MCF10CA1a metastatic cancer cells；B：RNA immunoprecipitation sequencing（RIP-seq）showed the combination of NATD with a single mRNA of the transferred gene in LM2 cells［the normalized reading distribution of Input（blue）and NATD（red）along the mRNA］；C：Western blot analysis of NATD protein expression levels in NATD knockdown LM2 and MCF10CA1a metastatic cancer cells.圖3 通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列和RIP-Seq分析鑒定NATD靶標(biāo)

討 論

隨著早期診斷和全身治療的進(jìn)步，大多數(shù)早期非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者被認(rèn)為有可能治愈［10］。然而，轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍然被認(rèn)為是無法治愈的，死亡率很高［11］。因此，探索轉(zhuǎn)移機(jī)制是開發(fā)更有效的乳腺癌療法的關(guān)鍵。EMT 是轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步，以促進(jìn)癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤逃逸［12］。在這項(xiàng)研究中，我們證明NATD 可能通過下調(diào)FOXA2的表達(dá)來抑制乳腺癌的EMT 和轉(zhuǎn)移。與其他研究一致，我們的數(shù)據(jù)揭示了NATD/FOXA2 軸在EMT 和乳腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，并表明NATD/FOXA2 軸是開發(fā)治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在分子靶點(diǎn)。

Figure 4. FOXA2 overexpression can inhibit the EMT and metastasis of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells were transfected with plasmids against NATD and/or FOXA2. A：the expression of NATD and FOXA2 protein were analyzed by Western blot（n=3）；B：Transwell analysis of MDA-MB-231 cells（n=3）；C：immunofluorescence detection of E-cadherin（green）and N-cadherin（red）immunofluorescence staining（n=3，×100）；D：the expression of E-cadherin，N-cadherin and vimentin protein were analyzed by Western blot（n=3）. Mean±SD.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs NATD group.圖4 FOXA2過表達(dá)可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移

組蛋白修飾在基因調(diào)控中具有重要作用［13］。然而，即使這種修飾很豐富，并且相應(yīng)的NAT酶在真核生物中高度保守，但是組蛋白H4的N-α-末端乙?；墓δ苋匀徊淮_定［14］。最近發(fā)現(xiàn)NAT酶在幾種人類癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中的關(guān)鍵作用突出了它們的重要臨床意義［15-16］。有研究證實(shí)，NATA 復(fù)合物（Naa10p，NATA 復(fù)合物的催化亞基）與腫瘤有關(guān)，并且對(duì)于維持增殖和確保各種癌細(xì)胞的存活至關(guān)重要［17］。由于NATD 催化活性僅限于組蛋白H4 和H2A，最近研究發(fā)現(xiàn)NATD 可通過不依賴p53 的機(jī)制在結(jié)直腸癌細(xì)胞中具有抗凋亡作用，并且NATD-KD 細(xì)胞對(duì)化療治劑表現(xiàn)出更高的敏感性［18］。此外，臨床觀察顯示，肺癌組織中的NATD 表達(dá)水平較鄰近的正常組織顯著升高，并且與患者的存活率呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了NATD促進(jìn)肺癌進(jìn)展［7］。本研究擴(kuò)展了先前的研究發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了NATD 在轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于親本癌細(xì)胞，并且NATD過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞顯著加劇了小鼠肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)。相比之下，NATD敲減的LM2 細(xì)胞減少了小鼠的肺定植并延長(zhǎng)了無轉(zhuǎn)移生存期。這些發(fā)現(xiàn)證明了NATD 在乳腺癌中的促轉(zhuǎn)移作用。

最近研究證實(shí)組蛋白修飾與EMT 密切相關(guān)［19］。要進(jìn)行EMT，癌細(xì)胞需要獲得除遺傳變化以外的表觀遺傳變化［20］。這項(xiàng)研究通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列RIP-Seq分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子FOXA2為NATD靶標(biāo)。FOXA2 屬于轉(zhuǎn)錄因子的叉頭/翼狀螺旋家族［21］，參與胚胎發(fā)育，并在來自三個(gè)胚層的多個(gè)成體組織中廣泛表達(dá)和發(fā)揮作用［22］。FOXA2在多種人類腫瘤中發(fā)揮作用，如肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌，并且FOXA2 的持續(xù)表達(dá)通?？梢苑乐股鲜瞿[瘤的進(jìn)展［23-25］。FOXA2 在正常人乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，但其表達(dá)因臨床乳腺癌樣本中FOXA2 基因甲基化增加而下調(diào)，表明 FOXA2 影響乳腺癌進(jìn)展［26］。FOXA（HNF-3）是維持上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，提示FOXA2 參與了EMT 的調(diào)控［27］。許多研究還證實(shí)，F(xiàn)OXA2 通過抑制各種人類腫瘤（如胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌）中的EMT，起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［28-30］。更重要的是，本研究中乳腺癌細(xì)胞中FOXA2的表達(dá)水平與NATD 的表達(dá)水平密切相關(guān)，過表達(dá)NATD 通過抑制FOXA2 表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)EMT 過程。這些發(fā)現(xiàn)確定了NATD 在基因表達(dá)調(diào)控中的新功能，并擴(kuò)展了我們對(duì)EMT 表觀遺傳調(diào)控的理解。在我們的結(jié)果中，F(xiàn)OXA2 是NATD 介導(dǎo)EMT 過程的直接表觀遺傳靶點(diǎn)。然而，考慮到NATD調(diào)節(jié)多個(gè)基因表達(dá)的能力，本研究不能完全排除由NATD 直接調(diào)節(jié)的其他基因有助于獨(dú)立于FOXA2表達(dá)的遷移和侵襲的可能性。

總之，在本研究中，我們首次證明NATD 通過控制FOXA2 介導(dǎo)的EMT 來促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果不僅揭示了乳腺癌轉(zhuǎn)移的新調(diào)控機(jī)制，而且為開發(fā)治療乳腺癌的新策略提供了潛在的靶點(diǎn)。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，靶向NATD/FOXA2 軸可能是治療乳腺癌的新策略。