蘇 萌，譚福雄，呂 潔，雷莉妍*

1陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽 712083；2西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，西安 710000

炎癥是機體受到創(chuàng)傷后感染或自身免疫損傷時產(chǎn)生的一種可溶性因子與細胞之間復雜的相互作用[1]。炎癥的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，病毒、細菌和真菌等病原體入侵都會誘發(fā)機體炎癥[2]。炎癥一旦產(chǎn)生，可能誘發(fā)嚴重的醫(yī)學后果。研究顯示，慢性或頻繁的炎癥可以誘發(fā)癌癥及自身免疫性疾病[3]。

藥對是介于單味藥和復方之間的配伍單元，既具有復方靈活加減的特性，又具有單味中藥化學成分相對簡單的特點[4]。知母-黃柏藥對出自《蘭室秘藏》，具有滋陰清熱、瀉火解毒的功效，主治陰虛火旺等癥[5]。知母-黃柏藥對在臨床上為常見藥對，多個方劑及中成藥都包含該配伍，研究表明該藥對或包含該藥對的方劑有一定的抗炎作用。Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn)知柏地黃丸可以調(diào)節(jié)炎性因子，促進炎性反應損傷的愈合。Zuo等[7]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，包含知母-黃柏的三花湯加減方治療慢性前列腺炎108例，有效率可達83.5%。并且有現(xiàn)代藥理研究顯示，知母-黃柏藥對對慢性前列腺炎也有顯著的治療作用[8]。本課題組前期研究顯示，知母-黃柏藥對水提液的30%乙醇洗脫部位在細胞水平有顯著的抗炎作用[9]。為了進一步探討知母-黃柏的抗炎機制，本研究擬先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)對知母-黃柏的抗炎機制進行預測，并通過細胞炎癥模型進行驗證。本研究將為知母-黃柏藥對的臨床應用及基礎(chǔ)研究提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

知母飲片(批號：20200301)、黃柏飲片(批號：20200301)購于陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格為1.0 kg；脫水淫羊藿素購于北京索萊寶公司(批號：412B022，純度98%)。

1.2 細胞

小鼠RAW 264.7細胞(編號：3131C0001000800 013)購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.3 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：2121143)購于美國Hyclone公司；胎牛血清(批號：1903320)購于以色列Biological Industries公司；青-鏈霉素(批號：0010419)購于以色列Biological Industries公司；IL-6、TNF-αELISA試劑盒(批號：M201210-004a，M201210-102a)購于深圳欣博盛生物科技有限公司；細胞級二甲基亞砜(批號：710N0310)購于北京索萊寶公司；無水乙醇(批號：20210508)購于天津市天力化學試劑有限公司。

1.4 儀器

311型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Thermo Multi-skan GO多功能酶標儀(美國Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；DSZ2000X型倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)；Agilent 1290型高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX 4500 Qtrap三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Agilent公司，美國AB SCIEX公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(Sartorius科學儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 知母-黃柏藥對網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接分析

1.5.1.1 知母-黃柏活性成分及靶點收集篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/index.php)分別搜索知母、黃柏的化學成分，按照生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的原則對各化合物進行篩選[10]。在TCMSP平臺篩選各活性成分的靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將得到的活性成分靶點蛋白轉(zhuǎn)化為相應的基因簡稱。

1.5.1.2 炎癥靶點收集及篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“inflammation”為關(guān)鍵詞檢索，得到炎癥相關(guān)的靶基因，去重復值后以“相關(guān)性得分”≥10進行篩選。借助于jvenn在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)繪制韋恩圖，將知母-黃柏的靶基因與炎癥靶基因相互映射，得到知母-黃柏干預炎癥的潛在靶基因。

1.5.1.3 構(gòu)建藥物-炎癥-靶基因可視化網(wǎng)絡(luò)

將知母-黃柏干預炎癥的靶基因和炎癥相關(guān)的靶基因?qū)隤erl語言中，得到網(wǎng)絡(luò)連線信息和節(jié)點類型等信息文件，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2中構(gòu)建藥物-炎癥-靶基因可視化網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件的插件cytohubba，分別根據(jù)degree值和最大集團中心度(maximal clique centrality，MCC)值篩選出前10個節(jié)點。

1.5.1.4 構(gòu)建知母-黃柏干預炎癥的互作網(wǎng)絡(luò)

為了直觀地了解知母-黃柏干預炎癥的潛在靶蛋白之間的相互作用，使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)導入靶基因，選擇物種為人(homo sapiens)，得到知母-黃柏干預炎癥靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及對應信息，隱藏無關(guān)的靶蛋白。將得到的信息導入R語言中，利用腳本得到前10個出現(xiàn)次數(shù)最多的靶點柱狀圖。

1.5.1.5 知母-黃柏干預炎癥靶基因的功能和通路分析

為進一步探究知母-黃柏干預炎癥靶點的相關(guān)功能和涉及的通路，本研究使用R語言BiocManager包將靶基因名稱轉(zhuǎn)換為基因ID，在此基礎(chǔ)上，再使用R語言的bioconductor包、DOSE包等程序包，得到相應基因ID的功能和通路。

1.5.1.6 知母-黃柏活性成分與靶點分子對接驗證

利用“1.5.1.3”得到的3個化學成分和7個靶點，從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載知母-黃柏3個核心化學成分的2D結(jié)構(gòu)，并保存為*mol格式，利用PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)搜索7個“Homo Sapiens”的核心靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)，下載其3D結(jié)構(gòu)并保存為*sdf格式。借助分子對接軟件sybyl V2.1.1進行修復殘基、加氫、構(gòu)建活性口袋、Surflex-Dock對接，導出*PDB格式。最后，通過pymol V2.4.0進行可視化處理。

1.5.2 知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量測定

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，洗脫梯度：0～60 min，5%→99% B；65 min，99%→5% B；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為5 μL。

1.5.2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI負離子模式進行掃描，檢測模式為多反應檢測(MRM)。離子化參數(shù)為離子噴霧電壓，負離子模式-4 500 V；霧化氣和輔助氣為氮氣；離子源溫度550 ℃，輔助氣GS1、GS2溫度為60 ℃，氣簾氣溫度35 ℃；離子掃描范圍：100～1 000 Da；掃描速率：200 Da/s；合物離子對，優(yōu)化后的采集參數(shù)：去簇電壓(DP)為134.34 V、碎裂能量(CE)為-35.03 eV和碰撞池出口電壓(CXP)為-9.11 V。

1.5.2.3 供試品的制備

精密稱取知母、黃柏各30 g，加300 mL水，浸泡30 min，小火煮沸，并保持微沸煎煮1 h。倒出水煎液，加240 mL水，微沸煎煮1 h，合并兩次濾液并濃縮為浸膏，保存于-20 ℃冰箱，備用。精密稱取10 mg，加入1 mL甲醇，超聲20 min，混勻后靜置，取上清，過0.22 μm濾膜，濾液用甲醇稀釋100倍，進樣量為5 μL。

1.5.2.4 對照品的制備

精密稱取脫水淫羊藿素0.62 mg,加入1 mL甲醇，過0.22 μm濾膜，濾液用甲醇稀釋100倍，進樣量為5 μL。

1.5.3 知母-黃柏藥對抗炎活性檢測

1.5.3.1 RAW 264.7細胞培養(yǎng)

RAW 264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3.2 藥物配制及實驗分組

稱取適量知母-黃柏藥對浸膏，用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配為2 mg/mL母液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

脫水淫羊藿素用細胞級二甲基亞砜(DMSO)配成10 mM儲液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選結(jié)果對知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎活性進行驗證，每個藥物設(shè)置空白組、模型組(即1 μg/mL LPS)、藥物不同濃度處理組。知母-黃柏藥物低、中、高不同濃度為5、7.5、10 μg/mL，脫水淫羊藿給藥低、中、高不同濃度組為2.5、5、7.5 μmol/L。

1.5.3.3 細胞相對存活力檢測

取對數(shù)期細胞以1×105個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，用不同濃度藥物預處理細胞1 h，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，空白組加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO孵育10 min，用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度值。

1.5.3.4 NO及炎癥細胞因子檢測

取對數(shù)期細胞以1×106個/孔接種于24孔板，細胞貼壁后，用不同濃度各藥物預處理細胞1 h，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，空白組加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。藥物處理20 h，收集各孔細胞上清，12 000 r/min離心15 min，取上清。采用Griess法測NO生成水平，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6分泌水平。

1.5.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與討論

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接結(jié)果

2.1.1 知母-黃柏藥對活性成分及靶點篩選結(jié)果

根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選后得到52個活性成分，其中知母15個，黃柏37個(見表1)。該52個活性成分在TCMSP中共檢索到619個靶點，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢對應名稱并去重復可得102個相關(guān)靶點。

表1 知母-黃柏化學成分基本信息

2.1.2 炎癥的靶點篩選結(jié)果

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫查找到有關(guān)炎癥的靶點共10 272個，通過去除重復值并以大于等于10分進行篩選，最終得到538個疾病靶基因。使用jevnn在線工具得到知母-黃柏干預炎癥的潛在靶基因22個(見圖1)。

圖1 知母-黃柏干預炎癥的靶基因

2.1.3 構(gòu)建藥物-炎癥-靶基因可視化網(wǎng)絡(luò)

以篩選出核心化合物及核心靶點為基礎(chǔ)，得到藥物-化學成分-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖，包含53個節(jié)點，106個邊(見圖2)。以degree與MCC同時滿足篩選出前10個活性較高的化學成分和靶點。結(jié)果顯示，degree、MCC結(jié)果相同(見圖3)，得到3個化學成分，分別為quercetin(槲皮素)、anhydroicaritin(脫水淫羊藿素)、β-sitosterd(β-谷甾醇)，7個靶點分別為VEGFA、RELA、PPARG、PRSS1、PTGS1、CASP3。

圖2 藥物-化學成分-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 重要活性成分-靶標圖

2.1.4 構(gòu)建知母-黃柏干預炎癥的互作網(wǎng)絡(luò)

為進一步分析知母-黃柏抗炎的關(guān)鍵靶點信息，使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索，并隱藏與其他蛋白無關(guān)的靶蛋白后，得到知母-黃柏干預炎癥的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。通過R語言處理得到前10個互作次數(shù)最多靶點柱狀圖(見圖5)。由圖可以看出，知母-黃柏干預炎癥的關(guān)鍵靶點與IL-6、VEGFA、CASP3、PPARG等密切相關(guān)。

圖4 知母-黃柏干預炎癥的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 互作次數(shù)多的靶點柱狀圖(前10個)

2.1.5 知母-黃柏干預炎癥靶基因GO及KEGG分析結(jié)果

用R語言腳本處理知母-黃柏干預炎癥的22個靶基因后得到63個GO富集相關(guān)的功能(見圖6)，83個KEGG富集的通路(見圖7)，根據(jù)P<0.01選擇發(fā)現(xiàn)GO為30個，KEGG為66個。篩選GO和KEGG各前20個進行條目分析。GO分析結(jié)果顯示，知母-黃柏治療炎癥靶點主要功能包括：激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細胞凋亡過程、轉(zhuǎn)錄因子活性等。通過KEGG富集分析后，發(fā)現(xiàn)知母-黃柏主要通過與TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、剪應力與動脈粥樣硬化及卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號通路發(fā)揮作用。

圖6 知母-黃柏干預炎癥靶基因的GO功能富集分析

圖7 知母-黃柏干預炎癥靶基因的KEGG通路富集分析

2.1.6 成分-靶點分子對接結(jié)果

利用Degree及MCC結(jié)果得到3個活性較高的化學成分和7個主要靶點進行分子對接，其中RELA未找到對應唯一受體蛋白，故不納入。分子對接結(jié)果如表2顯示，脫水淫羊藿素與PPARG結(jié)合作用打分最高，β-谷甾醇、槲皮素均與靶點NR3C1結(jié)合作用最強。選取上述3個成分與其打分最高的蛋白分子對接結(jié)果進行可視化處理(見圖8)。

表2 分子對接結(jié)果

圖8 核心成分與靶點分子對接結(jié)果圖

2.2 知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量測定結(jié)果

含量測定結(jié)果顯示，脫水淫羊藿素標準品的保留時間為48.91 min，知母-黃柏藥對中脫水淫羊藿素保留時間為49.25 min，經(jīng)計算知母-黃柏藥對中脫水淫羊藿素含量為18.04%(見圖9)。

圖9 知母-黃柏中脫水淫羊藿含量測定

2.3 知母-黃柏藥對抗炎活性

2.3.1 知母-黃柏及脫水淫羊藿素對RAW 264.7細胞存活率的影響

模型組與空白組比較，模型組細胞存活率顯著降低；與模型組比較，各藥物均可不同程度的保護LPS誘導的細胞損傷，其中脫水淫羊藿素高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學差異(見表3)。

表3 各組RAW 264.7細胞存活率比較

2.3.2 知母-黃柏及脫水淫羊藿素對RAW 264.7細胞NO、IL-6、TNF-α含量影響

與空白組比較，模型組NO、IL-6、TNF-α含量水平均顯著升高；與模型組比較，各藥物干預組不同程度降低NO、IL-6、TNF-α水平，且差異具有統(tǒng)計學意義。

表4 各組NO、TNF-α、IL-6含量水平比較

3 討論與結(jié)論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)知母-黃柏有顯著的抗炎作用，為了探討其抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機制，本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出知母-黃柏抗炎的核心化學成分槲皮素、β-谷甾醇和脫水淫羊藿素。有研究顯示，槲皮素可通過TLR4/NF-κB信號通路抑制小鼠RAW 264.7細胞炎癥，還可通過抑制NF-κB的表達有效地減輕人類風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞炎癥因子[10,11]。β-谷甾醇對啤酒中酵母誘導的大鼠發(fā)熱有良好的抗炎活性[12]。脫水淫羊藿素對酵母多糖誘導的小鼠腹膜炎具有顯著的保護作用，該作用可能與其抑制巨噬細胞鈣離子內(nèi)流及iNOS表達有關(guān)[13]。分子對接結(jié)果顯示，脫水淫羊藿素與PPARG、β-谷甾醇和槲皮素均與NR3C1結(jié)合有較高的結(jié)合活性，其中脫水淫羊藿素與PPARG對接結(jié)果打分最高。這提示，脫水淫羊藿素可能是知母-黃柏抗炎的主要活性成分。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的預測結(jié)果提示下，本研究檢測了知母-黃柏中脫水淫羊藿素的含量。結(jié)果顯示，脫水淫羊藿素在知母-黃柏中含量為18.04%。為進一步探究知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎活性及可能作用機制，我們在細胞水平研究了知母-黃柏及脫水淫羊藿素對相關(guān)炎癥因子生成的影響。結(jié)果表明，知母-黃柏及脫水淫羊藿素能顯著抑制LPS誘導的TNF-α、IL-6、NO生成。TNF信號通路是KEGG預測的知母-黃柏發(fā)揮抗炎作用最主要的通路。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)之一，過氧化物酶體增殖物激活受體是核受體超家族的一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。研究表明，TNF-α能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARγ)活性，降低PPARγ的表達，并進一步以PPARγ依賴的方式活化NF-κB通路[14-16]，NF-κB會進一步促進下游炎癥相關(guān)基因如IL-6、iNOS等的表達[17,18]，而NO為iNOS催化產(chǎn)生[19]。因此，本研究推測知母-黃柏通過TNF通路抗炎是其重要機制之一。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選知母-黃柏抗炎的成分、靶點及信號通路，利用分子對接技術(shù)驗證脫水淫羊藿素與核心靶點結(jié)合能力，并通過含量測定驗證知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量，細胞實驗驗證知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎作用，并對其抗炎的作用機制進行初步探討。本研究為藥物干預疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制研究提供了可借鑒的方法，為臨床知母-黃柏用藥提供了研究基礎(chǔ)。