尹 偉，胡 琪，李新章，周清浩，郁 陽，胥振國，范高福，張國升

1合肥職業(yè)技術學院 生物工程學院，合肥 238000；2南通睿灃新材料技術有限公司 化學成分分離鑒定中心，南通 226000；3中國科學技術大學高分子科學與工程系 中科院軟物質(zhì)化學重點實驗室，合肥 230026；4中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650201；5安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，合肥 230031

千年健(Homalomenaocculta(Lour.)Schott.)作為天南星科千年健屬植物，本屬植物約有140余種，主要分布于亞洲及美洲等地區(qū)，在我國的云南、海南、廣西、廣東等地為主要分布區(qū)域[1]。千年健于2000年收錄入《中國藥典》，主要用于風寒，風濕等疾病的治療?！侗静菥V目拾遺》中記載：“形如藤，長數(shù)尺，氣極香烈”。千年健傳統(tǒng)上主要以其干燥的根莖作為藥用，同時為少數(shù)民族習用，在針對痙攣麻木、風濕、類風濕關節(jié)炎、腰腿疼痛、胃腸功能炎癥以及骨折等方面具有很好的治療作用[2]。有研究報道[3]，該植物含有倍半萜、生物堿、酚酸以及揮發(fā)油等成分，具有很強的抗氧化、殺線蟲、細胞毒性以及抑菌活性，同時具有一定程度的抗炎作用[4]。亦有研究表明[5]，千年健中所含的倍半萜成分，能促進骨細胞增殖分化，間接抑制炎癥因子一氧化氮、前列腺素E2以及環(huán)氧化酶2的釋放，具有潛在的抗骨質(zhì)疏松作用。本文在前期研究的基礎上，進一步對千年健的化學成分進行分析，旨在發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤生理活性的化學成分，為完善天南星科植物的藥用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

質(zhì)譜儀(VG Auto-Spec-3000，Micromass公司)；核磁共振儀(Bruker DRX-500 MHz)；Büchi B-688型高效液相制備色譜儀(Büchi公司，瑞士)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-201，上?？婆d儀器有限公司)；酶標儀(BXS01-ELx-800，美國)。

1.2 藥材與試劑

千年健(Homalomenaocculta(Lour.)Schott.)由南通睿灃新材料技術有限公司提供(No.rfzy20201008)，由李新章、胡琪研究員鑒定為千年健。宮頸癌細胞(Hela)、人肺癌細胞(A549)、小鼠乳腺癌細胞(4T1)及人肝癌細胞(HepG2)(中國科學技術大學生科院)。肝癌細胞小鼠(H22、BALB/c)，清潔級，4～5周(中國科學技術大學生科院)；RPMI-1640培養(yǎng)基(北京君立康生物科技有限公司)；乙酸乙酯、甲醇、乙醇、三氯甲烷(成都金山化學試劑有限公司)；MTT(四甲基偶氮唑鹽，上海拜力生物技術有限公司)；甲氨蝶呤(河北阿爾泰生物科技有限公司)；DMSO(二甲基亞砜，Sigma公司)；Sephadex LH-20(50 μm，GE公司)；硅膠和薄層色譜硅膠(青島海洋化工公司)；顯色劑為碘蒸氣或10%硫酸-乙醇溶液(105 ℃加熱顯色)或在紫外燈254 nm及365 nm處觀察熒光。

1.3 提取與分離

稱取8.0 kg干燥千年健，粉碎后，室溫下用95%的乙醇浸提3次(每次36 h)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑減壓濃縮，最終得到浸膏約260 g。將浸膏中加入適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇有機溶劑進行充分萃取。隨后，濃縮乙酸乙酯萃取部分，得到浸膏約120 g。

乙酸乙酯部分通過正相硅膠色譜分離(200～300目)，三氯甲烷-甲醇洗脫系統(tǒng)(100∶0、100∶5、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100，V/V)梯度順序洗脫，經(jīng)過薄層色譜(TLC)檢測合并，最終得到6個部分(Fr.1～6)。Fr.1(29.7 g)經(jīng)反復硅膠柱洗脫、純化，最終使用Sephadex-LH20凝膠柱(三氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，V/V)純化，得到化合物1(22.3 mg)。Fr.2(22.7 g)通過反復硅膠柱分離，分別石油醚-丙酮洗脫(10∶1→0∶1，V/V)，MPLC(中壓制備，30%～100%乙腈，流速為1 mL/min)，隨后經(jīng)過Sephadex-LH20(純甲醇)凝膠柱純化，得到化合物8(10.2 mg)、2(22.7 mg)、4(24.8 mg)、5(11.9 mg)。Fr.3(30.5 g)通過硅膠柱色譜分離，分別石油醚-乙酸乙酯洗脫(10∶1→0∶1，V/V)，經(jīng)Sephadex-LH20(三氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，V/V)凝膠柱洗脫，丙酮重結(jié)晶得到化合物10(10.3 mg)、3(11.9 mg)。Fr.4(28.6 g)通過硅膠柱純化，石油醚-三氯甲烷-甲醇(5∶4∶1，V/V)洗脫，通過制備薄層色譜，三氯甲烷-丙酮(3∶2，V/V)得化合物7(25.1 mg)；經(jīng)Sephadex-LH20凝膠柱(三氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，V/V)洗脫純化，得到化合物9(12.4 mg)；經(jīng)三氯甲烷-丙酮(3∶1，V/V)，丙酮重結(jié)晶得化合物6(16.2 mg)。

1.4 細胞毒性試驗

稱取一定量化合物1～10，將其用DMSO溶解(二甲亞砜，濃度<3‰培養(yǎng)液體積分數(shù))，隨后超聲30 min，放冰箱冷藏，備用。體外抗腫瘤活性試驗，采取MTT法進行[6]。將對數(shù)生長期的各種腫瘤細胞(HepG2、A549、4T1及Hela)，稀釋成單細胞混懸液，以約1×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，放置培養(yǎng)箱中(37 ℃，5%的CO2)，培養(yǎng)24 h后，除去培養(yǎng)液，加入不同濃度的待測化合物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在測試前，在接種板的每孔加入MTT(5 mg/mL，30 μL)，繼續(xù)孵育3 h。使用酶聯(lián)免疫檢測儀，測定各個化合物吸光度(A，490 nm波長)。其中，細胞抑制率=(1-OD試驗組/OD對照組)×100%，分別計算得出每個化合物對各腫瘤細胞增殖抑制數(shù)值，其中，陽性對照藥物為甲氨蝶呤，最終得出IC50值(50%的腫瘤細胞增殖抑制數(shù)值對應的每個化合物的具體濃度)。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z479[M+Na]+，C30H48O3；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：3.09(1H，dd，J= 11.3，5.0 Hz，H-3)，3.02(1H，dt，J=10.9，4.8 Hz，H-19)，4.58(1H，br s，H-20)，0.92(3H，s，H-23)，0.70(3H，s，H-24)，0.80(3H，s，H-25)，0.90(3H，s，H-26)，0.90(3H，s，H-27)，4.69(1H，br s，H-29a)，4.47(1H，br s，H-29b)，1.60(3H，s，H-30)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：38.7(C-1)，C-2(27.1)，76.5(C-3)，38.5(C-4)，54.6(C-5)，18.2(C-6)，34.0(C-7)，40.4(C-8)，50.1(C-9)，37.0(C-10)，20.7(C-11)，25.3(C-12)，37.8(C-13)，42.2(C-14)，30.4(C-15)，31.9(C-16)，55.5(C-17)，46.8(C-18)，48.9(C-19)，150.4(C-20)，29.1(C-21)，36.8(C-22)，28.4(C-23)，15.7(C-24)，16.1(C-25)，15.9(C-26)，14.5(C-27)，177.6(C-28)，19.1(C-29)，109.9(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故鑒定化合物1為樺木酸。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z521[M + Na]+，C32H50O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.30(s，1H，H-12)，4.53(s，1H，H-3a)，2.86(dd，J= 13.4，3.5 Hz，1H，H-18b)，2.10(s，3H，OAc)，1.29(s，3H，Me)，1.17(s，3H，Me)，0.99(d，J= 8.8 Hz，6H，2×Me)，0.93(s，3H，Me)，0.91(s，3H，Me)，0.78(s，3H，Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.2(C-1)，23.6(C-2)，80.8(C-3)，37.8(C-4)，55.3(C-5)，18.3(C-6)，32.7(C-7)，39.3(C-8)，47.4(C-9)，37.0(C-10)，22.7(C-11)，122.4(C-12)，143.7(C-13)，41.3(C-14)，40.7(C-15)，23.4(C-16)，45.9(C-17)，46.7(C-19)，30.8(C-20)，33.8(C-21)，32.5(C-22)，28.2(C-23)，16.8(C-24)，15.5(C-25)，17.3(C-26)，25.8(C-27)，27.6(C-15)，184.5(C-28)，23.7(C-29)，33.2(C-30)，21.5(CH3CO)，171.1(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故鑒定該化合物2為 3β-acetoxyolean-12-en-28-oic acid。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z479[M+Na]+，C30H48O3；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.17(1H，t，J= 3.4 Hz，H-12)，2.99(1H，dd，J= 5.1 Hz，H-3)，1.10(3H，s，H-27)，0.94(3H，s，H-23)，0.97(3H，d，J= 6.8 Hz，H-29)，0.90(3H，s，H-26)，0.83(3H，d，J= 6.7 Hz，H-30)，0.78(3H，s，H-24)，0.71(3H，s，H-25)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：38.1(C-1)，22.6(C-2)，76.9(C-3)，38.6(C-4)，52.6(C-5)，17.2(C-6)，36.4(C-7)，38.8(C-8)，47.3(C-9)，38.0(C-10)，23.4(C-11，C-23)，124.8(C-12)，138.7(C-13)，41.8(C-14)，32.8(C-15)，21.4(C-16)，47.0(C-17)，54.7(C-18)，30.1(C-19)，28.5(C-20)，27.6(C-21)，36.2(C-22)，16.7(C-24)，16.4(C-25)，15.3(C-26)，27.1(C-27)，178.6(C-28)，18.3(C-29)，23.9(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故鑒定化合物3為熊果酸。

化合物4白色固體粉末；ESI-MS：m/z341[M + Na]+，C20H30O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.24(dd，J= 12.1，2.5 Hz，1H，H-20)，4.21(d，J= 12.1 Hz，1H，H-20)，2.20～0.81(m，27H，Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：19.8(C-2)，36.8(C-3)，37.5(C-4)，50.2(C-5)，21.5(C-6)，38.7(C-7)，43.8(C-8)，49.3(C-9)，42.1(C-10)，16.6(C-11)，24.8(C-12)，47.2(C-13)，39.7(C-14)，56.8(C-15)，78.1(C-16)，23.5(C-17)，22.2(C-18)，175.7(C-19)，73.0(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定該化合物4為antriptolactone。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z415[M-H]-，C21H20O9；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.60(1H，s，OH)，8.00(1H，d，J= 9.8 Hz，H-4)，6.98(1H，s，H-5)，6.79(2H，s，H-2′，6′)，6.42(1H，d，J= 9.8 Hz，H-3)，4.99(1H，d，J= 8.2 Hz，H-7′)，4.41(1H，m，H-8′)，3.86(3H，s，OMe)，3.91(6H，s，2×OMe)，3.76(1H，s，H-9′a)，3.41(1H，m，H-9′b)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：160.2(C-2)，113.6(C-3)，145.8(C-4)，101.2(C-5)，145.6(C-6)，137.8(C-7)，131.3(C-8)，138.2(C-9)，111.8(C-10)，125.3(C-1′)，105.7(C-2′，6′)，148.2(C-3′，5′)，136.7(C-4′)，76.9(C-7′)，77.5(C-8′)，60.2(C-9′)，56.7(3′，5′-OMe)，56.1(6-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物5為黃花菜木脂素C。

化合物6無色針晶；ESI-MS：m/z257.1[M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：4.21(1H，d，J= 4.5 Hz，OH)，4.00(1H，s，OH)，3.71(1H，s，OH)，3.21(1H，ddd，J= 11.5，4.5，4.5 Hz，H-1)，1.92(1H，d，J= 13.6 Hz，H-5)，1.17(3H，s，H-15)，1.13(3H，s，H-12)，1.12(3H，s，H-13)，0.91(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：78.9(C-1)，40.6(C-2)，41.8(C-3)，70.5(C-4)，59.6(C-5)，32.2(C-6)，51.9(C-7)，32.6(C-8)，28.6(C-9)，47.3(C-10)，70.8(C-11)，31.9(C-12)，30.8(C-13)，15.3(C-14)，30.7(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物6為bullatantriol。

化合物7白色無定形粉末；ESI-MS：m/z257.1[M+ H]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：4.38(1H，dd，J=11.3，4.3Hz，H-6)，3.29(1H，dd，J=9.9，4.4 Hz，H-1)，1.80(1H，d，J=11.2 Hz，H-5)，1.32(3H，s，H-15)，1.17(3H，d，J=6.9 Hz，H-12)，0.97(3H，d，J=6.8 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：78.9(C-1)，28.6(C-2)，36.1(C-3)，73.0(C-4)，50.9(C-5)，72.3(C-6)，47.5(C-7)，22.7(C-8)，36.1(C-9)，40.9(C-10)，25.4(C-11)，21.7(C-12)，24.1(C-13)，13.8(C-14)，23.8(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物7為菠蘿香藤素。

化合物8白色無定形粉末；ESI-MS：m/z257.2[M+H]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.90(1H，dd，J= 12.9，9.7 Hz，H-6)，3.15(1H，dd，J= 11.5，4.6 Hz，H-1)，1.10(1H，d，J= 9.5 Hz，H-5)，1.47(3H，s，H-15)，1.08(3H，s，H-14)，0.91(3H，d，J= 6.6 Hz，H-12)，0.86(3H，d，J= 6.9 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：78.6(C-1)，27.3(C-2)，41.7(C-3)，71.3(C-4)，57.0(C-5)，68.7(C-6)，52.0(C-7)，18.6(C-8)，38.0(C-9)，41.0(C-10)，25.9(C-11)，20.8(C-12)，15.7(C-13)，12.2(C-14)，34.0(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物8為mucrolidin。

化合物9黃色粉末；ESI-MS：m/z257[M+H]+，C15H14O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.13(1H，s，5-OH)，10.87(1H，s，7-OH)，7.33～7.57(5H，m，Ph)，5.95(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，5.61(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.53(1H，dd，J= 12.3，2.5 Hz，H-2)，3.21(1H，dd，J= 17.2，12.4 Hz，H-3a)，2.73(1H，dd，J= 17.2，3.7 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.4(C-2)，43.6(C-3)，193.2(C-4)，163.8(C-5)，95.0(C-6)，167.1(C-7)，96.3(C-8)，162.6(C-9)，100.3(C-10)，138.1(C-1′)，127.8(C-2′，6′)，129.1(C-3′，5′)，127.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物9為 pinocembrin。

化合物10黃色固體粉末；ESI-MS：m/z177[M-H]-，C10H10O3；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：9.57(1H，t，J= 6.7 Hz，H-3)，7.33～7.37(1H，m，H-2′)，7.11(1H，dd，J= 8.1，1.7 Hz，H-6′)，7.07(1H，d，J= 1.5 Hz，H-5′)，6.85(1H，dd，J= 11.4，7.6 Hz，H-1)，6.50(1H，dd，J= 15.3，7.9 Hz，H-2)，3.84(3H，d，J= 4.4 Hz，OMe)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：126.2(C-1)，126.7(C-2)，194.3(C-3)，55.8(-OMe)，147.4(C-1′)，109.9(C-2′)，153.6(C-3′)，149.5(C-4′)，115.2(C-5′)，124.3(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定該化合物10為 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propenal。

2.2 體外抗腫瘤活性試驗

2.2.1 細胞毒性試驗

采用SPSS 22.0軟件，數(shù)據(jù)分析采用t檢驗，檢驗水準α= 0.05，以P< 0.05表示差異符合統(tǒng)計學概念。對各化合物進行體外抗腫瘤活性篩選，通過抗腫瘤藥物甲氨蝶呤作為陽性對照，研究各化合物對腫瘤細胞的細胞毒活性。細胞毒活性試驗結(jié)果顯示，化合物2、4、9對四株腫瘤細胞(Hela、HepG2、4T1、A549)的增殖具有相應的抑制作用，能夠在一定程度抑制上述四種腫瘤細胞的生長?；衔?、4、9的細胞毒活性數(shù)據(jù)見表1。

表1 化合物2、4、9的細胞毒活性

2.2.2 化合物的細胞毒性(活細胞/死細胞分析)

為了直觀的分析化合物2、4、9的細胞毒性，本研究選取4T1腫瘤細胞，具體實驗步驟，參考了文獻[17]。分析各化合物對4T1的細胞毒性。直接觀察化合物處理后的細胞狀態(tài)(經(jīng)AM/PI染色處理后的各種圖像)，其中活細胞(綠色)、死細胞(紅色)，與不同劑量抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(2 μg/mL，20 μg/mL)對比，化合物2、4、9也具有良好的抗癌能力，與上述細胞毒性的試驗(MTT法)結(jié)論一致。結(jié)果如圖1所示。

圖1 化合物2、4、9及甲氨蝶呤藥物對4T1細胞處理后狀態(tài)

2.2.3 細胞毒性機理試驗

通過上述“2.2.2”的各化合物對腫瘤細胞的毒性試驗，發(fā)現(xiàn)化合物2、4、9對各腫瘤細胞有較強的損傷，為了具體評估各化合物對腫瘤細胞的損傷情況，本研究進行了單細胞凝膠電泳實驗，即“彗星”試驗。選取4T1腫瘤細胞，使用不同劑量抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(2 μg/mL，20 μg/mL)作為對照，分析其細胞DNA的損傷情況。試驗步驟參照文獻[18]進行，結(jié)果如圖2所示。

圖2 單細胞凝膠電泳實驗

2.3 化合物體內(nèi)抑瘤試驗

通過4T1荷瘤小鼠，觀察化合物2、4、9的抑瘤效果，參照文獻方法[19,20]，得到小鼠腫瘤的指標生長曲線。將4T1荷瘤小鼠隨機分成5組(PBS組、化合物2組、化合物4組、化合物9組、甲氨蝶呤組)，在隨后的第0、3、6、9天，對小鼠腹腔注射待測化合物2、4、9及抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(陽性對照組)，藥物濃度均為10 mg/kg(按小鼠體重計)，其中，PBS組(生理鹽水)為對照組。給藥后的21天，將小鼠處死，記錄小鼠的腫瘤的生長狀態(tài)(體積、重量等)。結(jié)果如圖3所示。

圖3 荷瘤小鼠的抑瘤試驗

3 結(jié)論

本文主要研究了千年健的化學成分及抗腫瘤作用，應用中壓制備液相、Sephadex LH-20等分離手段，從千年健醇提溶液中分離得到10個化合物。除化合物7、8外，本實驗所分離得到的其余化合物，均為首次從千年健植物中分離。

研究發(fā)現(xiàn)了化合物2、4、9對4T1、A549、Hela及HepG2腫瘤細胞有很強的毒性。在對4T1荷瘤小鼠的體內(nèi)試驗時，化合物2、4、9組對荷瘤小鼠小的腫瘤生長指標(腫瘤體積、重量等)方面，與甲氨蝶呤的治療對比，有較強的效果。

本文在前期研究的基礎上，針對千年健的化學成分、體內(nèi)、外的抗腫瘤作用等多方面進行研究，旨在發(fā)現(xiàn)千年健中具有抗腫瘤生理活性的化學成分，從而進一步完善天南星科植物的藥用價值。