鄭乾明， 柏自琴， 王小柯， 林 乾， 王 彬， 馬玉華

(貴州省果樹科學(xué)研究所， 貴州 貴陽550006)

0 引言

【研究意義】火龍果(Hylocereus.spp)是仙人掌科(Cactaceae)多年生草本攀援果樹，目前主要在我國(guó)臺(tái)灣、廣西、廣東、海南、云南、貴州和福建等地種植。在生產(chǎn)上火龍果普遍利用成熟莖進(jìn)行無性繁殖，導(dǎo)致多種病毒大量積累，影響植株正常生長(zhǎng)和開花結(jié)果[1]。分離侵染火龍果的病毒基因組序列，分析其遺傳變異特點(diǎn)，有助于了解病毒傳播規(guī)律和建立高效的分子檢測(cè)體系，為苗木檢疫、病毒早期檢測(cè)和防控奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】自2001年以來，火龍果受馬鈴薯X病毒屬的仙人掌X病毒(CactusvirusX，CVX)[1-3]、蟹爪蘭X病毒(ZygocactusvirusX，ZyVX)[3-4]和仙人指X病毒(SchlumbergeravirusX，SchVX)[3-5]侵染。近期報(bào)道花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)桿狀DNA病毒屬(Badnavirus)火龍果桿狀DNA病毒1(Pitayabadnavirus1，PiBV1)也侵染貴州火龍果[6]。CVX最早在我國(guó)臺(tái)灣省種植的疑似病毒感染火龍果植株中發(fā)現(xiàn)[1]，其基因組(GenBank登錄號(hào)：AF308158)全長(zhǎng)約6.6 kb，為單分體正義單鏈RNA病毒[2]。共編碼5個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，分別為依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)、TGB1蛋白(Trige gene block 1)、TGB2、TGB 3和外殼蛋白(Coat protein，CP)。近年來，隨著火龍果種植區(qū)域的快速擴(kuò)大，在我國(guó)海南省[7-8]和貴州省[3,9]、韓國(guó)濟(jì)州島[10]、美國(guó)佛羅里達(dá)州[11]均有CVX侵染火龍果的相關(guān)報(bào)道。RT-PCR檢測(cè)表明，海南省和貴州省火龍果的CVX檢出率分別達(dá)86.7%和93.4%[8-9]。CVX-NTU(GenBank登錄號(hào)：JF937699)是在我國(guó)臺(tái)灣省首次報(bào)道的CVX的一個(gè)株系，其基因組序列與CVX一致性為78%。此前對(duì)貴州火龍果樣品的宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，CVX-NTU占病毒序列數(shù)量的85%，并拼接獲得1條近基因組全長(zhǎng)序列[3]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】CVX和CVX-NTU普遍侵染火龍果，目前報(bào)道的基因組全長(zhǎng)序列較少，不能系統(tǒng)研究其遺傳變異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】獲得侵染火龍果的CVX和CVX-NTU基因組序列，分析其序列特征，了解病毒群體的遺傳變異，為建立分子檢測(cè)和防控體系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感染病毒的火龍果樣品采自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣和黔南州羅甸縣的火龍果種植園，品種為紅肉火龍果“紫紅龍”，采集期為盛果期。從莖表面表現(xiàn)褪綠、黃化等典型疑似病毒病癥狀的植株上采集樣品，立即用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品擦凈后自然晾干，去除莖表面的角質(zhì)層，切成約3 mm薄片。錫箔紙包裹后液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 參照文獻(xiàn)[3]的方法對(duì)樣品進(jìn)行總RNA提取、濃度和質(zhì)量檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序。測(cè)序獲得的Raw read進(jìn)行質(zhì)控和過濾，產(chǎn)生的高質(zhì)量Clean read利用Trinity v2.1.1軟件組裝成contig[12]。contig序列分別使用BLASTN和BLASTX程序在NCBI非冗余核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，設(shè)置E值<10-5。

1.2.2 序列分析 使用在線ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)病毒基因組中的ORF。在線的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列一致性計(jì)算使用NCBI網(wǎng)站的BLASTN程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，本地的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列一致性計(jì)算使用Lasergene軟件(DNAStar公司)中的MegAlign程序。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 從 NCBI網(wǎng)站下載侵染火龍果的CVXs(AF308158和LC128411)和CVX-NTUs(JF937699和KX883791)基因組序列，以及侵染火龍果的ZyVX(AF366208)、SchVX(AY366207)和PiVX(JF930327)等序列，同時(shí)下載侵染仙人掌科的OpVX(AY366209)為外類群。使用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，然后利用MEGA7.0軟件構(gòu)建基于鄰位相接法的系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值檢驗(yàn)進(jìn)行1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒相關(guān)序列篩選

分析宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中獲得的contig序列，根據(jù)注釋結(jié)果篩選CVX和CVX-NTU相關(guān)序列(表1)，獲得CVX貴州火龍果分離物相關(guān)序列4條，長(zhǎng)度為6 500～6 580 bp，分別命名為CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP，其基因組5′端缺失24～125個(gè)核苷酸，3′端缺失10～32個(gè)或增加5個(gè)核苷酸，覆蓋參考基因組CVX(AF308158)全長(zhǎng)的96.2%～99.5%。獲得CVX-NTU貴州火龍果分離物相關(guān)序列5條，長(zhǎng)度為6 563～6 603 bp，分別命名為CVX-NTU-LW、CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-ZYP，其基因組5′端缺失24～33個(gè)核苷酸，在3′端最多缺失39個(gè)核苷酸，覆蓋參考基因組CVX-NTU(JF937699)全長(zhǎng)的99.0%～99.6%。

表1 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的CVX和CVX-NTU貴州火龍果分離物基因組序列

2.2 CVX基因組結(jié)構(gòu)變異

從表2看出，以CVX(AF308158)為參考，貴州火龍果分離物(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)及CVX-Jeju(LC128411)均出現(xiàn)若干一致的單堿基插入與缺失變異。在編碼RdRP的ORF中，第4 349個(gè)和4 635個(gè)核苷酸處分別插入1個(gè)堿基，第4 359個(gè)、4 541個(gè)、4 574個(gè)、4 589個(gè)和4 656個(gè)核苷酸處分別缺失1個(gè)堿基。在編碼CP的ORF中，第6 133個(gè)、6 147個(gè)和6 163個(gè)核苷酸處分別插入1個(gè)堿基。

表2 CVX貴州火龍果分離物與參考基因組CVX(AF308158)的序列變異

2.3 CVX、CVX-NTU貴州火龍果分離物的序列差異

2.3.1 CVX序列差異 4條CVX貴州火龍果分離物(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)之間基因組序列一致性為98.3%～98.6%，與CVX(AF308158)一致性為97.5%～98.0%，與CVX-Jeju(LC128411)一致性為97.1%～97.4%(表3)，與NCBI中僅有部分序列的CVX分離物一致性為96.5%～99.4%。

CVX貴州火龍果分離物RdRP編碼的氨基酸序列之間一致性為98.6%～99.3%，高于其與CVX(AF308158)和CVX-Jeju的一致性(表4)。貴州分離物TGB1編碼的氨基酸序列之間一致性為99.1%～99.6%，高于與CVX-Jeju的一致性，低于與CVX(AF308158)的一致性。貴州分離物TGB2編碼的氨基酸序列之間一致性為96.4%～98.2%，基本等同于其與CVX(AF308158)和CVX-Jeju的序列一致性。貴州分離物TGB3編碼的氨基酸序列之間一致性為98.4%～100%，略高于其與CVX(AF308158)和CVX-Jeju的一致性。貴州分離物CP氨基酸序列之間一致性為98.2%～100%，明顯高于其與CVX(AF308158)的一致性。

2.3.2 CVX-NTU序列差異 5條CVX-NTU貴州火龍果分離物(CVX-NTU-LW、CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-ZYP)之間基因組序列一致性為98.1%～98.8%，與CVX-NTU(JF937699)一致性為97.7%～97.9%，與SCM51431(KX883791)的一致性為97.6%～99.1%，與CVX-NTU-GZ分離物的一致性97.9%～98.1%(表3)，與NCBI中僅有部分序列的CVX-NTU分離物的序列一致性為94.9%～99.1%。

表3 CVX和CVX-NTU貴州火龍果分離物與其他分離物的基因組序列一致性

從表4看出，CVX-NTU貴州火龍果分離物RdRP氨基酸序列之間一致性為98.8%～99.6%，略高于與CVX-NTU(JF937699)的一致性。貴州分離物TGB1氨基酸序列之間一致性為99.1%～100%，基本等同于其與CVX-NTU(JF937699)、SCM51431和CVX-NTU-GZ的一致性。貴州分離物TGB2氨基酸序列之間一致性為99.1%～100%，略高于其與CVX-NTU(JF937699)和CVX-NTU-GZ的序列一致性。貴州分離物TGB3氨基酸序列之間一致性為100%，高于其與CVX-NTU-GZ的序列一致性。貴州分離物CP氨基酸序列之間一致性為99.6%～100%，均高于其與CVX-NTU(JF937699)、SCM51431和CVX-NTU-GZ的序列一致性。

表4 CVX和CVX-NTU貴州火龍果分離物與其他分離物ORF編碼的氨基酸序列一致性

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化

將CVXs和CVX-NTUs及侵染火龍果的馬鈴薯X病毒屬病毒ZyVX、SchVX和PiVX共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。基于基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖1)，CVXs和CVX-NTUs分別位于不同的類群，與ZyVX、SchVX、PiVX和OpVX明顯分開。4個(gè)CVX貴州火龍果分離物聚為一類，未發(fā)生明顯遺傳分化。CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-GZ聚為一類，CVX-NTU-LW、CVX-NTU-ZYP和SCM51431聚為一類，未表現(xiàn)出明顯的遺傳分化規(guī)律。

圖1 CVX和CVX-NTU貴州火龍果分離物基于基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

目前在NCBI提交的CVX和CVX-NTU株系序列共27條，其中5條為基因組全長(zhǎng)序列，大部分僅為基因組序列片段。宏基因組或宏轉(zhuǎn)錄組隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展而來，廣泛用于鑒定病毒種類、獲得基因組全長(zhǎng)、分析病毒群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性[13]。對(duì)多年生園藝作物采用富集病毒小RNA[14-15]，去寄主核糖體RNA[16-17]，或富集病毒雙鏈RNA[18-19]等策略，成功分離并獲得多種病毒的基因組序列。本研究采用去寄主核糖體RNA構(gòu)建測(cè)序文庫，共獲得CVX和CVX-NTU株系相關(guān)的9條近全長(zhǎng)基因組序列，極大擴(kuò)充了目前CVX群體的基因組數(shù)據(jù)庫。

4條CVX貴州火龍果分離物(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)近全長(zhǎng)基因組序列與NCBI中參考序列CVX(AF308158)相比，出現(xiàn)10處單堿基的插入或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)移碼突變，改變多個(gè)氨基酸的種類和序列。綜合分析推測(cè)，本研究獲得的CVX貴州分離物與參考序列CVX相比，其出現(xiàn)上述變異的可能性不大，而是由于參考序列CVX測(cè)序出錯(cuò)導(dǎo)致。首先，參考序列CVX基因組經(jīng)分段RT-PCR擴(kuò)增，然后對(duì)若干克隆測(cè)序獲得，其測(cè)序克隆數(shù)量一般較少，準(zhǔn)確率略低[2]。其次，本研究采用的Illumina測(cè)序具有高深度和高準(zhǔn)確率的特點(diǎn)[13]，4條CVX貴州分離物序列在上述10處位點(diǎn)完全一致，同時(shí)CVX-Jeju分離物序列在上述位點(diǎn)也與CVX貴州分離物完全一致。并且，目前侵染火龍果的馬鈴薯X病毒屬其他病毒[3-5]，均未出現(xiàn)如此大范圍的堿基插入或缺失等造成的移碼突變。因此，未來有必要重新明確高質(zhì)量的CVX基因組全長(zhǎng)序列作為參考基因組。

CVX貴州火龍果分離物與CVX(AF308158)和CVX-Jeju構(gòu)成的CVX群體基因組序列一致性為97.1%～98.6%，略高于包括SchVX貴州火龍果分離物在內(nèi)的病毒群體[5]，顯著高于包括ZyVX貴州火龍果分離物在內(nèi)的病毒群體[20]。CVX貴州分離物之間的RdRP、TGB1、TGB3和CP編碼的氨基酸序列一致性較高，僅TGB2編碼的氨基酸序列一致性略低。比較CVX貴州分離物與CVX-Jeju分離物的ORF編碼氨基酸序列，其序列一致性水平接近于CVX貴州分離物之間。比較CVX貴州分離物與CVX(AF308158)的RdRP和CP編碼氨基酸序列，其序列一致性水平均低于CVX貴州分離物之間。較低的序列一致性主要源于堿基插入或缺失造成的移碼突變，但根據(jù)上述推測(cè)可知其并不存在。系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明，4個(gè)CVX貴州分離物聚為一類，與CVX(AF308158)和CVX-Jeju未呈現(xiàn)明顯遺傳分化規(guī)律。因此，當(dāng)前CVX群體的遺傳變異均為單核苷酸變異，其基因組和ORF編碼的氨基酸序列變異較小，未發(fā)生明顯遺傳分化。

CVX-NTU貴州火龍果分離物與其他3個(gè)具有基因組全長(zhǎng)的分離物共同構(gòu)成CVX-NTU群體，其基因組序列一致性為97.6%～99.1%。CVX-NTU貴州分離物之間基因組序列一致性為98.1%～98.8%，略高于此前報(bào)道的包括CVX-NTU-GZ在內(nèi)的病毒群體[3]，明顯高于包括ZyVX貴州火龍果分離物在內(nèi)的病毒群體[20]。氨基酸序列一致性表明，CVX-NTU貴州分離物5個(gè)ORF編碼的氨基酸序列一致性較高，與其他3個(gè)分離物的序列一致性水平基本一致。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析，共同說明目前CVX-NTU群體的遺傳變異較小，未表現(xiàn)明顯的遺傳分化規(guī)律。

4 結(jié)論

研究獲得4條CVX(CVX-LW、CVX-RF、CVX-ZNS和CVX-ZYP)和5條CVX-NTU(CVX-NTU-LW、CVX-NTU-RF、CVX-NTU-ZNF、CVX-NTU-ZNS和CVX-NTU-ZYP)貴州火龍果分離物近全長(zhǎng)基因組序列，長(zhǎng)度為6 494～6 603 bp，覆蓋參考基因組96.2%～99.6%。CVX貴州分離物之間的基因組序列一致性為98.3%～98.6%，與已報(bào)道的其他分離物基因組序列一致性為97.1%～98.0%。CVX-NTU貴州分離物之間的基因組序列一致性為98.1%～98.8%，與已報(bào)道的其他分離物基因組序列一致性為97.6%～99.1%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CVX和CVX-NTU群體未出現(xiàn)明顯的遺傳分化。

研究基于宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得CVX及其CVX-NTU株系的9條貴州火龍果分離物近全長(zhǎng)基因組序列，顯著擴(kuò)大了當(dāng)前CVX群體的基因組序列數(shù)量。目前CVX及CVX-NTU株系群體基因組的遺傳變異較小，尚未發(fā)生明顯的遺傳分化。上述特點(diǎn)有助于快速建立病毒的分子檢測(cè)體系，為苗木檢疫、病毒早期檢測(cè)和防控奠定理論基礎(chǔ)。