孫建輝，郝莉雨，李宗源, 2，于澤玥，霍海如，吳子倫，李綺婧，張宏萌*，李洪梅*

小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒致小鼠病毒性肺炎的影響

孫建輝1，郝莉雨1，李宗源1, 2，于澤玥1，霍海如1，吳子倫1，李綺婧3，張宏萌3*，李洪梅1*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700 2.江蘇大學(xué)，江蘇 鎮(zhèn)江 212013 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

研究小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒致小鼠病毒性肺炎的治療作用。將ICR小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）高、中、低劑量（21.6、10.8、5.4 mL/kg）組和磷酸奧司他韋膠囊（39 mg/kg）組，除對(duì)照組外，其余各組小鼠滴鼻感染甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1構(gòu)建小鼠病毒性肺炎模型，測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量和肺指數(shù)；采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色考察肺組織病理變化；檢測(cè)肺組織中病毒載量以及流感病毒感染致小鼠死亡的存活時(shí)間。小鼠感染流感病毒后，體質(zhì)量明顯降低（＜0.01），肺指數(shù)、血清中IL-6水平明顯升高（＜0.01）。與模型組相比，小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）組小鼠體質(zhì)量明顯升高（＜0.01）；肺指數(shù)明顯降低（＜0.05、0.01）；肺組織、肺泡出血、水腫、肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍炎癥等病變明顯減輕；血清中IL-6水平降低（＜0.01）；肺組織病毒載量明顯降低（＜0.05）；小鼠存活時(shí)間明顯延長（＜0.05）。小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）能夠降低病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)及肺組織病毒載量，改善病毒感染所致肺組織病理形態(tài)學(xué)異常，延長病毒感染小鼠存活時(shí)間，提示小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒所致的病毒性肺炎具有治療作用，其作用機(jī)制可能與改善炎癥、降低病毒載量等有關(guān)。

小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）；流感病毒；病毒性肺炎；炎癥；病毒載量

流行性感冒是一種由流感病毒引起的具有高度傳染性的人畜共患急性呼吸道疾病[1]，其根據(jù)病毒核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原性的差異可分為甲、乙、丙、丁4種類型[2]，其中甲型流感病毒宿主范圍較廣，易發(fā)生抗原性漂移和轉(zhuǎn)換[3]。甲型流感多數(shù)確診患者有發(fā)熱表現(xiàn)，患者體溫升高，病性屬“溫?zé)帷保瑢儆谥嗅t(yī)新發(fā)溫病[4]。

中藥具有整體調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)治療的特點(diǎn)，能在退熱、消炎、抗病毒的同時(shí)提高人體免疫功能，比單一抗病毒藥物減輕上呼吸道癥狀更具優(yōu)勢(shì)[5]。小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）由金銀花、連翹、板藍(lán)根、薄荷、柴胡、牛蒡子、荊芥穗、石膏、黃芩、梔子、桔梗、赤芍、蘆根、炒苦杏仁、淡竹葉、枳殼、炒六神曲、僵蠶、防風(fēng)、甘草20味藥經(jīng)煎煮后濃縮，沉淀、濾過，再歷經(jīng)灌裝、滅菌等現(xiàn)代化制藥先進(jìn)工藝制成，具有辛涼解表、清熱解毒、止咳利咽的功效，并根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒的作用，適用于發(fā)熱、咳嗽、咳痰、鼻塞流涕、咽喉紅腫疼痛等癥狀[6]，在臨床應(yīng)用中對(duì)于兒童甲型流行性感冒[7]、小兒急性上呼吸道感染（風(fēng)熱感冒證）[8]等亦具有良好的治療效果。本研究采用甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1溶液滴鼻感染小鼠構(gòu)建小鼠流感病毒性肺炎模型，評(píng)價(jià)小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)病毒性肺炎小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)、炎癥因子、肺組織病理形態(tài)學(xué)、肺組織病毒載量、存活時(shí)間等的影響，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）抗流感病毒的作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，本實(shí)驗(yàn)室傳代后于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量13～15 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2級(jí)生物安全室，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，給予滅菌維持飼料、純凈水飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)2020D017。

1.3 藥品與試劑

小兒風(fēng)熱清合劑（口服液，批號(hào)S03520001，60 mL/瓶，每毫升相當(dāng)于飲片2.0 g）由邯鄲制藥股份有限公司提供；達(dá)菲?磷酸奧司他韋膠囊（以奧司他韋計(jì)75 mg/粒，批號(hào)M1046）購自Roche Registration Ltd；乙醚（批號(hào)20181009）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)221503-000）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；引物由Invitrogen公司合成；TRNzol總RNA提取試劑（批號(hào)03420）購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（批號(hào)AJ92011A）、DL2000 DNA Marker（批號(hào)A2301A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.4 儀器

MC1.8型生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA3202S-CW型、BSA323S-CW型電子天平（賽多利斯儀器有限公司）；AL-204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；ABI7500型qRT-PCR儀（Applied Biosystems公司）；Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Luminex 200多因子檢測(cè)儀（Luminex公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

ICR小鼠120只，分為2批，每批60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分組，分別為對(duì)照組、模型組及小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）高、中、低劑量（21.6、10.8、5.4 mL/kg，分別相當(dāng)于臨床2.0、1.0、0.5倍劑量）組和磷酸奧司他韋膠囊（39 mg/kg，相當(dāng)于臨床2倍劑量）組，每組10只，雌雄各半，一批用于肺組織病毒載量測(cè)定，另一批用于病理學(xué)和細(xì)胞因子測(cè)定；ICR小鼠110只，按體質(zhì)量隨機(jī)分組，分別為對(duì)照組、模型組及小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）高、中、低劑量（21.6、10.8、5.4 mL/kg，分別相當(dāng)于臨床2.0、1.0、0.5倍劑量）組和磷酸奧司他韋膠囊（39 mg/kg，相當(dāng)于臨床2倍劑量）組，除對(duì)照組10只小鼠外，其余各組每組20只，雌雄各半，用于小鼠存活時(shí)間測(cè)定。

2.2 小鼠流感病毒性肺炎模型建立

造模方法參照文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行改進(jìn)：除對(duì)照組外，其余各組小鼠以乙醚輕度麻醉，用流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1溶液滴鼻感染小鼠，0.05 mL/只[15倍半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）]，造成小鼠流感病毒性肺炎模型。感染當(dāng)天開始各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續(xù)5 d。

2.3 血清IL-6水平的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第6天稱定小鼠體質(zhì)量后，取血，分離血清，按ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清中IL-6水平。

2.4 肺指數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第6天取血后處死小鼠，固定、解剖，摘取肺組織稱定質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)。

肺指數(shù)＝肺質(zhì)量/體質(zhì)量

2.5 肺組織病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)第6天小鼠肺組織稱定質(zhì)量后，于10%甲醛溶液中固定，48 h后取出流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 肺組織病毒載量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第6天取血后處死小鼠，固定、解剖，摘取肺組織稱定質(zhì)量后，放置于無菌離心管中，凍存于液氮中，采用RT-PCR測(cè)定肺組織病毒載量。

2.7 小鼠存活時(shí)間的測(cè)定

從造模第1天開始計(jì)算，觀察14 d內(nèi)小鼠死亡情況，計(jì)算小鼠中位生存時(shí)間、平均存活時(shí)間和存活時(shí)間延長率。

中位生存時(shí)間＝存活率在50%時(shí)對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間

平均存活時(shí)間＝存活時(shí)間之和/該組動(dòng)物只數(shù)

存活時(shí)間延長率＝(給藥組平均生存時(shí)間－模型組平均生存時(shí)間)/模型組生存時(shí)間

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，組間多重比較分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)合最小顯著性差異法（LSD）多重比較分析。

3 結(jié)果

3.1 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠體質(zhì)量和肺指數(shù)的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（＜0.01），肺指數(shù)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量明顯升高（＜0.01），肺指數(shù)明顯降低（＜0.05、0.01）。

表1 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠體質(zhì)量和肺指數(shù)的影響(, n = 20)

Table 1 Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on body weight and lung index of viral pneumonia mice (, n = 20)

組別劑量體質(zhì)量/g肺指數(shù) 對(duì)照—21.19±1.370.832±0.069 模型—17.02±1.27**1.419±0.201** 磷酸奧司他韋膠囊39 mg·kg?119.26±1.04##1.033±0.093## 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）21.6 mL·kg?118.68±1.28##1.211±0.162## 10.8 mL·kg?118.18±1.22##1.291±0.149# 5.4 mL·kg?118.53±1.22##1.208±0.167##

與對(duì)照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

3.2 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠血清中IL-6水平的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-6水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）高、中劑量組小鼠血清中IL-6水平明顯降低（＜0.01）。

3.3 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺組織和支氣管病理變化的影響

如圖1、2所示，對(duì)照組小鼠肺組織肺泡內(nèi)未見有炎性滲出，間質(zhì)未見炎癥、水腫，肺泡未見有融合，肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍未見有炎癥浸潤，氣管內(nèi)未見有脫落物，細(xì)支氣管內(nèi)膜細(xì)胞正常。模型組小鼠肺組織肺泡間質(zhì)內(nèi)大面積炎性出血、瘀血，炎癥滲出較彌漫，以淋巴細(xì)胞為主，少部分小鼠有多量中性粒細(xì)胞、分葉核細(xì)胞等其他炎癥細(xì)胞滲出，部分小鼠肺泡融合，肺組織間質(zhì)有明顯水腫；肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍有明顯炎癥浸潤，以淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、分葉核細(xì)胞為主，細(xì)支氣管內(nèi)膜有節(jié)段性脫落，病變較彌漫。各給藥組小鼠肺組織、肺泡出血、水腫、肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍炎癥等病變與模型組相比有不同程度地減輕。對(duì)肺部病變和支氣管病變進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3、4。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織和支氣管病變明顯（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組肺組織和支氣管病變均有明顯改善（＜0.05、0.01）。

表2 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠血清中IL-6水平的影響(, n = 10)

Table 2 Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on IL-6 level in serum of viral pneumonia mice (, n = 10)

組別劑量IL-6/(pg·mL?1) 對(duì)照—4.375±3.501 模型—57.458±27.221** 磷酸奧司他韋膠囊39 mg·kg?134.199±34.779 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）21.6 mL·kg?125.265±16.682## 10.8 mL·kg?128.869±8.227## 5.4 mL·kg?141.535±13.796

圖1 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺組織病理變化的影響 (HE, ×400)

圖2 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠支氣管組織病理變化的影響 (HE, ×200)

表3 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺組織病理變化的影響(, n = 10)

Table 3 Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on pathological changes of lung tissue of viral pneumonia mice (, n = 10)

組別劑量n/只秩和檢驗(yàn)P值 —＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 對(duì)照—10///// 模型—//154** 磷酸奧司他韋膠囊39 mg·kg?1/361/## 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）21.6 mL·kg?1/154/# 10.8 mL·kg?1/154/# 5.4 mL·kg?1/163/##

“－”：小鼠肺組織肺泡內(nèi)未見有滲出，間質(zhì)未見有炎癥，肺泡未見有融合，肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍未見炎癥，組織結(jié)構(gòu)正常；“＋”：小鼠肺組織肺泡間質(zhì)有輕度紅血球及少量淋巴細(xì)胞滲出，B細(xì)胞未見有明顯增生、增大，肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍未見有明顯炎癥；“＋＋”：小鼠肺組織肺泡內(nèi)間質(zhì)有輕度瘀血，有炎癥滲出，以淋巴細(xì)胞為主，少量中性分葉核滲出，組織有輕度水腫，肺內(nèi)部分細(xì)支氣管周圍有炎癥滲出；“＋＋＋”：小鼠肺組織肺泡間質(zhì)內(nèi)大面積炎性出血、瘀血，肺間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞滲出，以淋巴細(xì)胞為主，并有多量中性粒細(xì)胞分葉核滲出，肺間質(zhì)內(nèi)有大量粉色血漿滲出，組織有水腫，肺泡有融合，肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍炎癥浸潤；“＋＋＋＋”：小鼠肺組織肺泡間質(zhì)大面積炎性出血，肺間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞滲出，以淋巴細(xì)胞為主，并有多量中性分葉核細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)有大量血漿滲出，組織有水腫，肺泡有融合；肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍大量炎癥滲出，肌組織細(xì)胞有增生、增大，病變較重、較彌漫，“/”為無 與對(duì)照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，表4同

“—”: no exudation in alveoli, no inflammation in interstitium, no fusion of alveoli, no inflammation around bronchioles in lung, normal tissue structure; “+”: there were mild red blood cells and a small amount of lymphocyte exudation in alveolar interstitium, no obvious proliferation and enlargement of B cells, and no obvious inflammation around bronchioles in lungs; “++”: alveolar interstitium in lung tissue of mice, mild blood stasis, inflammatory exudation, mainly lymphocytes, a small amount of neutral lobulated nuclear exudation, mild tissue edema, and inflammatory exudation around some bronchioles in lung; “+++”: large area of ??inflammatory hemorrhage and blood stasis in alveolar interstitium of lung tissue, a large number of inflammatory cells exuded in interstitial lung, mainly lymphocytes, and a large number of neutrophilic lobulated nuclei exuded, and a large number of inflammatory cells in interstitial lung pink plasma exudates, tissue edema, alveolar fusion, and inflammatory infiltration around bronchioles in lung; “++++”: large area of??inflammatory hemorrhage in alveolar interstitium of lung tissue, with a large number of inflammatory cells exuding in pulmonary interstitium, mainly lymphocytes, with a large number of neutral lobulated nucleated cells exuding, a large amount of plasma exudation in pulmonary interstitium, tissue edema, and alveolar fusion; a large number of inflammatory exudates around bronchioles in lung, and muscle tissue cells hyperplasia, enlargement, heavier and more diffuse lesions, “/” means none**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group, same as table 4

表4 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠支氣管組織病理變化的影響(, n = 10)

Table 4 Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on pathological changes of bronchial histopathology of viral pneumonia mice (, n = 10)

組別劑量n/只秩和檢驗(yàn)P值 —＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 對(duì)照—10///// 模型—//163** 磷酸奧司他韋膠囊39 mg·kg?1/361/## 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）21.6 mL·kg?1/154/# 10.8 mL·kg?1/154/# 5.4 mL·kg?1/163/##

3.4 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠病毒載量的影響

如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中病毒載量明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）中劑量組和磷酸奧司韋膠囊組肺組織病毒載量顯著降低（＜0.05、0.01）。

表5 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒性肺炎小鼠病毒載量的影響(, n = 10)

Table 5 Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on viral load of lung tissue of viral pneumonia mice (, n = 10)

組別劑量病毒載量/(×108拷貝數(shù)·μL?1 cDNA) 對(duì)照—0.04±0.00 模型—1.80±0.42** 磷酸奧司韋膠囊39 mg·kg?10.50±0.68## 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）21.6 mL·kg?11.32±0.59 10.8 mL·kg?11.16±0.69# 5.4 mL·kg?12.43±1.13

3.5 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒感染致小鼠死亡的影響

各組小鼠生存曲線見圖3。如表6所示，與模型組比較，小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）高劑量組和磷酸奧司他韋膠囊組小鼠平均生存時(shí)間明顯延長（＜0.05），存活時(shí)間延長率分別為53.0%、23.5%。

圖3 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒感染致小鼠生存曲線的影響

表6 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)病毒感染致小鼠存活時(shí)間的影響()

Table 6 Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on survival time of mice with influenza virus infection ()

組別劑量n/只中位生存時(shí)間/d平均生存時(shí)間/d延長率/% 對(duì)照—1014.014.0±0.0— 模型—208.08.3±1.7**— 磷酸奧司他韋膠囊39 mg·kg?12014.012.7±2.1##53.0 小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）21.6 mL·kg?1209.010.0±2.4#20.5 10.8 mL·kg?1208.59.3±2.212.0 5.4 mL·kg?1208.09.1±2.39.0

4 討論

流行性感冒是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，在世界范圍內(nèi)引起暴發(fā)和流行。流感起病急，雖然大多為自限性，但部分因出現(xiàn)肺炎等并發(fā)癥可發(fā)展至重癥流感，少數(shù)重癥病例病情進(jìn)展快，可因急性呼吸窘迫綜合征或多臟器衰竭而死亡[10]。在中醫(yī)理論中，流感屬于“疫病”范疇，有風(fēng)寒、風(fēng)熱之分[11]，但臨床以風(fēng)熱為多，外感風(fēng)熱為基本病機(jī)，可見發(fā)熱、咳喘、咽喉腫痛、胸痛、痰中帶血、苔黃、脈數(shù)等癥狀，屬中醫(yī)風(fēng)溫病范疇，治療上多用辛涼解表合用清熱解毒之法[12]。

本研究使用甲型H1N1流感FM1株滴鼻感染小鼠，造成病毒性肺炎模型，該造模方式操作簡便，小鼠感染流感病毒后，模型組小鼠體質(zhì)量較對(duì)照組明顯降低，肺指數(shù)明顯升高，并經(jīng)病毒載量測(cè)定結(jié)果佐證，說明本次甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型建立成功。給予小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）后，與模型組相比，各給藥組體質(zhì)量明顯提高，肺指數(shù)值明顯降低，肺組織、肺泡出血、水腫、肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍炎癥等病變明顯減輕，肺組織中病毒載量明顯降低，小鼠存活時(shí)間延長，說明小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒引起的病毒性肺炎有一定的治療與緩解作用。

小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）中金銀花為中藥治療流感常用清熱解毒藥，如雙黃連口服液、連花清瘟膠囊等均以金銀花為君藥，常與連翹配伍[13]，行辛涼解表、芳香辟穢、清瘟解毒、宣肺泄熱之功，常用于流行性感冒等熱毒襲肺證的治療，其可在透解衛(wèi)分表邪的同時(shí)，兼顧溫?zé)岵⌒岸鄪A穢濁之氣的特點(diǎn)[14]，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花中所含有的槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分，可通過調(diào)節(jié)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）[15]、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）以及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）/p38 MAPK[16]等信號(hào)通路，改善流感病毒所帶來的炎癥反應(yīng)，并通過抑制相關(guān)蛋白表達(dá)[17]，起到對(duì)抗流感病毒的效果。連翹味苦，性微寒，歸肺、心、膽經(jīng)，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效，常與金銀花配伍用于外感風(fēng)熱或熱病初起[18]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，二者配伍使用，主要針對(duì)于炎癥性疾病[19]，并可明顯降低實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)IL-6水平[20]。IL-6是一種介導(dǎo)炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，研究顯示，流感病毒感染人體后，呼吸道局部和血清中IL-6水平與臨床癥狀密切相關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，病毒感染后小鼠血清中IL-6水平明顯升高，而給予小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）后，高、中劑量組小鼠血清中IL-6明顯降低，說明小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒所致病毒性肺炎的治療作用，可能與改善炎癥相關(guān)，該結(jié)果也與前人研究結(jié)果相符。

本研究通過構(gòu)建病毒性肺炎模型來模擬感染流感后的疾病狀態(tài)，以臨床2倍劑量的奧司他韋膠囊作為陽性對(duì)照組，以此展開小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感的治療作用探索。研究結(jié)果表明，小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）能夠降低小鼠肺指數(shù)和肺組織病毒載量，改善病毒感染所致肺組織病理形態(tài)學(xué)改變；延長病毒感染小鼠存活時(shí)間，提示小兒風(fēng)熱清合劑（口服液）對(duì)流感病毒所致的病毒性肺炎具有治療作用，其作用機(jī)制可能與改善炎癥、降低病毒載量等相關(guān)，為臨床用于兒童流行性感冒、風(fēng)熱感冒證提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Medina R A.1918 influenza virus: 100 years on, are we prepared against the next influenza pandemic? [J]., 2018, 16(2): 61-62.

[2] 楊延龍, 涂明利, 謝明水.PI3K抑制劑對(duì)甲型流感病毒FM1感染誘導(dǎo)病毒性肺炎小鼠肺組織中NO生成及炎癥反應(yīng)的影響 [J].病毒學(xué)報(bào), 2019, 35(5): 713-720.

[3] Ferguson L, Olivier A K, Genova S,.Pathogenesis of influenza D virus in cattle [J]., 2016, 90(12): 5636-5642.

[4] 王振中, 鮑琳琳, 孫蘭, 等.熱毒寧注射液抗甲型H1N1流感病毒作用機(jī)制研究 [J].中草藥, 2014, 45(1): 90-93.

[5] 周沁陽, 蔡文濤, 陳勇.中藥抗流感病毒活性及作用機(jī)制研究新進(jìn)展 [J].中草藥, 2019, 50(7): 1719-1726.

[6] 王艷榮, 王險(xiǎn)峰, 陳軍, 等.小兒風(fēng)熱清口服液輔助治療兒童手足口病30例 [J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2011, 30(8): 1037-1038.

[7] 馮自威, 杜永剛.小兒風(fēng)熱清治療兒童甲型流行性感冒療效觀察 [J].中醫(yī)藥臨床雜志, 2020, 32(7): 1296-1299.

[8] 周叢笑, 王俊宏, 陳竹, 等.小兒風(fēng)熱清合劑治療小兒急性上呼吸道感染(風(fēng)熱感冒證) 的多中心臨床研究 [J].藥物評(píng)價(jià)研究, 2020, 43(12): 2450-2456.

[9] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué) [M].北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1993: 251.

[10] 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì), 國家中醫(yī)藥管理局.流行性感冒診療方案 (2018年版) [J].中國感染控制雜志, 2018, 17(2): 181-184.

[11] 呂小琴, 張磊, 狄浩然, 等.流行性感冒研究進(jìn)展概要 [J].世界中醫(yī)藥, 2018, 13(2): 278-282.

[12] 方藥中.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科學(xué) [M].上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1985: 86-91.

[13] 李苗苗, 楊勤軍, 童佳兵, 等.中藥治療流行性感冒組方用藥規(guī)律研究 [J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 23(9): 172-177.

[14] 高凱, 宋延平.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探索金銀花用于甲型H1N1流感的分子機(jī)制 [J].中國新藥雜志, 2020, 29(23): 2729-2737.

[15] Zhang R H, Ai X, Duan Y J,.Kaempferol ameliorates H9N2 swine influenza virus-induced acute lung injury by inactivation of TLR4/MyD88-mediated NF-κB and MAPK signaling pathways [J]., 2017, 89: 660-672.

[16] Li R N, Hong P, Zheng X.Β-carotene attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation via inhibition of the NF-κB, JAK2/STAT3 and JNK/p38 MAPK signaling pathways in macrophages [J]., 2019, 90(1): 140-148.

[17] 萬巧鳳, 吳莉, 楊美玲, 等.槲皮素對(duì)甲型H1N1流感病毒誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的影響 [J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2011, 18(10): 42-44.

[18] 李立, 杜雅薇, 寇爽, 等.金銀花、連翹對(duì)甲型H1N1流感免疫調(diào)節(jié)通路影響的生物信息學(xué)分析 [J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(10): 201-204.

[19] 吳嘉瑞, 金燕萍, 王凱歡, 等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“金銀花-連翹”藥對(duì)作用機(jī)制分析 [J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(5): 179-183.

[20] 林麗美, 王智民, 王金華, 等.金銀花、連翹及銀翹藥對(duì)水煎劑的抗炎、解熱作用研究 [J].中國中藥雜志, 2008, 33(4): 473-475.

[21] Hussell T, Pennycook A, Openshaw P J.Inhibition of tumor necrosis factor reduces the severity of virus specific lung immunopathology [J]., 2001, 31(9): 2566-2573.

Effect of Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) on viral pneumonia mice model infected with influenza virus

SUN Jian-hui1, HAO Li-yu1, LI Zong-yuan1, 2, YU Ze-yue1, HUO Hai-ru1, WU Zi-lun1,LI Qi-jing3, ZHANG Hong-meng3, LI Hong-mei1

1.Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2.Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China 3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

To study the therapeutic effect of Xiaoer Fengreqing Mixture Oral Liquid [小兒風(fēng)熱清合劑(口服液)] on viral pneumonia mice model infected with influenza virus.ICR mice were randomly divided into control group, model group, Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) high-, medium-, and low-dose (21.6, 10.8, 5.4 mL/kg)groups and oseltamivir phosphate capsule (39 mg/kg) group according to weight body.Except for control group, mice in other groups were infected with influenza A virus mouse lung-adapted strain FM1intranasally to construct a mouse viral pneumonia model, body weight and lung index of mice in each group were determined; Interleukin-6 (IL-6) level in serum of mice was detected by ELISA; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to investigate the pathological changes of lung tissue; Viral load in lung tissue and survival time of mice killed by influenza virus infection were detected.After mice were infected with influenza virus, body weight was significantly decreased (< 0.01), lung index and IL-6 level in serum were significantly increased (< 0.01).Compared with model group, body weight of mice in Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid ) group was significantly increased (< 0.01); Lung index was significantly decreased (< 0.05, 0.01); Lung tissue, alveolar hemorrhage, edema, inflammation around bronchioles in lung and other lesions were significantly reduced; IL-6 level in serum was decreased (< 0.01); Viral load in lung tissue was significantly decreased (< 0.05); Survival time of mice was significantly prolonged (< 0.05).Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) can reduce lung index and viral load of lung tissue in mice with viral pneumonia, improve the pathological abnormality of lung tissue caused by virus infection, and prolong the survival time of virus infected mice, suggesting that Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid) has a therapeutic effect on viral pneumonia caused by influenza virus, and its mechanism may be related to improving inflammation and reducing viral load.

Xiaoer Fengreqing Mixture (Oral Liquid); influenza virus;viral pneumonia; inflammation; viral load

R285.5

A

0253 - 2670(2022)09 - 2740 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.017

2022-01-18

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2015FY111500-012）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017CXG1301）

孫建輝（1969—），男，副主任技師，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c毒理。Tel: 13501031386 E-mail: sjh121858@sina.com

通信作者：李洪梅（1979—），博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚砑靶滤庨_發(fā)。E-mail: lihm2006@sina.cn

張宏萌（1979—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚硌芯俊-mail: 13869123903@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]