張萌萌，王 丹，魏大能，葉 洵，何 林，龐文強，彭 偉，吳純潔

基于血清藥物化學的花椒溫中止痛的質(zhì)量標志物研究

張萌萌，王 丹，魏大能，葉 洵，何 林，龐文強，彭 偉*，吳純潔*

成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137

基于中藥質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）概念，在驗證花椒溫中止痛功效的基礎(chǔ)上，分析花椒提取物在正常大鼠及模型大鼠的血中移行成分。采用ig冰水結(jié)合冰浴方式建立寒邪犯胃型胃脘痛大鼠模型，并連續(xù)ig花椒提取物2周，觀察大鼠一般情況，并對全血血細胞計數(shù)、臟器指數(shù)和胃組織病理變化進行檢測。應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對對照組、模型組、空白給藥組、花椒高劑量組大鼠的血清樣本數(shù)據(jù)進行采集，通過主成分分析和正交偏最小二乘判別法分析花椒溫中止痛的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。通過PharmMapper反向?qū)雍Y選入血成分的作用靶點，并進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖；應(yīng)用分子對接技術(shù)對主要作用通路進行驗證。與模型組比較，花椒組大鼠耳廓顏色明顯變紅，全血白細胞、淋巴細胞及單核巨噬細胞計數(shù)明顯升高（＜0.05），胸腺指數(shù)明顯增加（＜0.01）；胃組織局部壞死脫落和變性細胞減少。從空白給藥組、花椒高劑量組大鼠血清中共鑒定出7個入血成分，其中4個為原型成分（羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-ε-山椒素、二羥基-α-山椒素），3個為代謝產(chǎn)物；其中二羥基-α-山椒素僅存在于花椒高劑量組大鼠血清?；ń啡胙煞挚梢酝ㄟ^氫鍵等形式與過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信號通路、Th17細胞分化相關(guān)的靶點蛋白[脂肪酸結(jié)合蛋白3（fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3）、視黃醇類X受體β（retinoid X receptor beta，RXRB）、FABP7、Janus激酶3（Janus kinase 3，JAK3）]良好結(jié)合?；ń房赡苁峭ㄟ^PPAR、Th17細胞分化信號通路調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮溫中止痛功效；羥基山椒素類化合物可作為花椒溫中止痛功效的潛在Q-Marker進行深入研究。

花椒；溫中止痛；血清藥物化學；質(zhì)量標志物；羥基-α-山椒素；羥基-β-山椒素；羥基-ε-山椒素；二羥基-α-山椒素

花椒為蕓香科花椒屬植物花椒Maxim.或青椒Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，是重要的中藥材和調(diào)味品，以四川漢源、甘肅武都、陜西韓城等為主要產(chǎn)區(qū)[1-2]?；ń犯缓S富的化學成分，主要包括酰胺類、萜類、黃酮、香豆素、木脂素和脂肪酸等[3-5]。東漢時期，花椒就已廣泛用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉等癥。張仲景《金匱要略》記載的大建中湯方（《古代經(jīng)典名方目錄》（第一批）），是以蜀椒為君藥的溫里劑，具有溫中補虛、降逆止痛的功效，主治心胸中大寒痛、嘔不能飲食、腹中寒等癥[6]。王為群等[7]從本草文獻中篩選治療胃脘痛的有效方藥，發(fā)現(xiàn)花椒等溫里藥是治療胃脘痛的常用方藥。黃燕瓊等[8]、秦華珍等[9]研究發(fā)現(xiàn)花椒等溫中散寒藥可以通過改善大鼠胃黏膜及血流變等發(fā)揮治療胃實寒證的藥效。盡管花椒溫中止痛功效有一定研究，但仍多集中在理論探討方面，并未見對功效相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)進行深入研究。

中藥質(zhì)量標志物（quality marker，Q-Marker）是中藥質(zhì)量控制的新概念，有效性是Q-Marker的核心要素[10]。中藥血清藥物化學依據(jù)中藥經(jīng)口給藥的特點，通過分析給藥后進入血液的化學成分及其代謝產(chǎn)物，從血中移行成分的角度，研究中藥功效相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。正常及病理狀態(tài)下動物對同一種中藥或提取物的吸收存在較為明顯的差異[12]，因此，有必要對花椒在正常及病理狀態(tài)下的血清藥物化學進行同步分析。本研究通過建立寒邪犯胃型胃脘痛大鼠模型，對花椒傳統(tǒng)功效溫中止痛進行驗證；采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/ orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析，對正常大鼠和模型大鼠給予花椒的含藥血清進行分析，分析并鑒定正常和病理狀態(tài)下血中移行成分。

1 材料

1.1 儀器

VanquishTM超高效液相色譜儀、Q-Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；十萬分之一電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；H1850R型臺式離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；BC-6800型血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司）。

1.2 藥品與試劑

花椒超臨界提取物（批號2020072201）購自吉安中香天然植物有限公司；對照品羥基-α-山椒素（批號RP200528，質(zhì)量分數(shù)＞98%）、羥基-β-山椒素（批號RP201110，質(zhì)量分數(shù)＞99%）、羥基-ε-山椒素（批號RP201031，質(zhì)量分數(shù)＞99%）購自成都麥德生科技有限公司；附子理中丸（批號20011316，9 g/丸）購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司；色譜級甲醇、乙腈購自美國Merck公司。

1.3 動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，6～7周齡，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、濕度50%～60%、12 h/12 h晝夜交替光照的環(huán)境中，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號2020-18）。

1.4 數(shù)據(jù)庫及軟件

PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）；UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）；RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）；Cytoscape 3.9.0軟件；Discovery Studio軟件。

2 方法

2.1 供試藥液的制備

精密稱取適量花椒超臨界提取物，加入0.1%泊洛沙姆188研磨均勻，少量多次加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）配制成質(zhì)量濃度分別為2.0、1.0、0.5 mg/mL的藥液，4 ℃冰箱密閉儲存?zhèn)溆谩?/p>

取附子理中丸適量，加入0.5% CMC-Na溶液（含0.1%泊洛沙姆）研磨均勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥液，4 ℃冰箱密閉儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（0.5% CMC-Na溶液）、空白給藥組（花椒溶液20 mg/kg）、模型組（0.5% CMC-Na溶液）、附子理中丸組（附子理中丸溶液1 g/kg）和花椒低、中、高劑量組（花椒溶液5、10、20 mg/kg），每組6只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)2周。

2.3 動物模型的制備

參考文獻方法[13]，造模同時給藥。除對照組和空白給藥組外，其余大鼠ig 0 ℃冰水（20 mL/kg），2次/d（分別為9: 00時和21: 00時），并增加10 ℃涼水泡浴（13: 00時），1次/d，15 min/次，連續(xù)2周，制備寒邪犯胃型胃脘痛模型。

2.4 動物標本采集及處理

末次造模及給藥結(jié)束后，全部大鼠禁食不禁水18 h。次日，對照組、空白給藥組、模型組、花椒高劑量組大鼠ig相應(yīng)藥物，給藥結(jié)束后0.5、1.0、2.0、4.0 h分別于頸靜脈取血0.2 mL，靜置2 h，3000 r/min離心15 min，取上層血清50 μL，合并各大鼠4個時間點血清，每組各得6個血清樣本，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采血結(jié)束后，所有大鼠ip 3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，用一次性EDTAK2負壓管于腹主動脈取血，用于血細胞計數(shù)檢測；解剖大鼠，結(jié)扎胃賁門和幽門，將胃組織完整取下，沿胃大彎剖開，用生理鹽水漂洗，置于4%多聚甲醛固定，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察大鼠胃組織病理變化；取胸腺、脾臟稱定質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。

2.5 大鼠血清樣品的制備

取血清樣品，解凍，加入3倍量沉淀劑[乙腈-醋酸乙酯（2∶3）]渦旋混合3 min，4 ℃靜置60 min沉淀蛋白，取出，渦旋1 min，超聲5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，37 ℃氮氣吹干，加入200 μL乙腈復溶，進行UPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS分析。

2.6 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS檢測條件

Thermo Fisher Scientific Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，88%～62% A；15～20 min，62%～55% A；20～35 min，55%～34% A；35～50 min，34%～2% A；50～60 min，2% A；體積流量為0.3 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。

采用正離子模式采集，熱噴霧離子源（HESI），噴霧電壓為＋3500 V；毛細管溫度為320 ℃；鞘氣流速35 arb；輔助氣流速10 arb；采集范圍100～1000。

2.7 數(shù)據(jù)分析

將對照組、空白給藥組、模型組、花椒高劑量組的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入Compound Discoverer 3.0軟件中，導入目標成分，建立代謝產(chǎn)物預測流程，分析各成分代謝途徑及代謝產(chǎn)物，并結(jié)合目標成分的相對分子質(zhì)量、二級碎片離子等進行鑒定。通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計比較組間差異，并篩選VIP＞1.0且＜0.05的成分。

2.8 花椒入血成分作用靶點篩選及驗證

以代表性入血成分為研究對象，采用PharmMapper反向?qū)雍Y選各成分的作用靶點。通過PubChem數(shù)據(jù)庫檢索成分英文名，獲取并下載2D結(jié)構(gòu)的sdf文件，將其導入PharmMapper數(shù)據(jù)庫，預測可能匹配和對接的體內(nèi)藥物靶標。選取分子-靶點匹配度（fit Score）≥3的藥物靶點作為潛在作用靶標[14]，通過UniProt數(shù)據(jù)庫校正靶點名稱。通過Metascape數(shù)據(jù)庫對標準化的靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

應(yīng)用分子對接技術(shù)對KEGG通路進行驗證。將RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載的蛋白靶點及入血成分mol格式導入Discovery studio 4.5軟件，利用LibDock模塊進行分子對接，以LibDock Score值作為評價指標。

2.9 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 花椒提取物對寒邪犯胃型胃脘痛大鼠一般情況的影響

造模過程中，模型組大鼠出現(xiàn)明顯寒相，癥見大鼠蜷縮、扎堆、耳廓顏色淡紅無華，甚至蒼白；經(jīng)花椒提取物或附子理中丸干預后，大鼠狀態(tài)明顯改善，耳廓顏色變紅。各組大鼠代表性耳廓顏色見圖1-A。

3.2 花椒提取物對寒邪犯胃型胃脘痛大鼠胃組織病理及臟器指數(shù)的影響

如圖1-B所示，對照組大鼠胃組織黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層組織結(jié)構(gòu)完整，細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列整齊；模型組大鼠胃黏膜上皮細胞見局部壞死脫落和細胞變性，固有膜內(nèi)局部見少量嗜酸性粒細胞；花椒高、中劑量組及附子理中丸組大鼠的胃組織病理狀態(tài)較模型組有明顯改善，僅見少量細胞核變大；花椒低劑量組仍有胃黏膜層上皮細胞壞死脫落現(xiàn)象。

如圖1-C所示，與對照組比較，模型組大鼠胸腺指數(shù)明顯降低（＜0.01），表明造模后大鼠免疫器官受到一定影響；與模型組比較，各給藥組大鼠胸腺指數(shù)均顯著增加（＜0.01），基本趨近正常組。各組大鼠脾臟指數(shù)沒有明顯差異。

3.3 花椒提取物對寒邪犯胃型胃脘痛大鼠全血血細胞的影響

各組大鼠全血血細胞分析結(jié)果見表1。與對照組比較，模型組大鼠全血白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、單核巨噬細胞及嗜堿性粒細胞計數(shù)均明顯降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，附子理中丸組和花椒中、高劑量組大鼠白細胞、淋巴細胞和單核巨噬細胞計數(shù)明顯升高（＜0.05、0.01），附子理中丸組中性粒細胞明顯升高（＜0.05）?；ń返蛣┝拷M各血細胞計數(shù)均無顯著差異。

3.4 生物樣本色譜圖的建立與分析

對照組、空白給藥組、模型組及花椒高劑量組的大鼠血清樣本檢測發(fā)現(xiàn)各成分及代謝物在60 min內(nèi)得到較好的分離，各組血清樣本的正離子模式下的總離子流圖見圖2。結(jié)果顯示，血清中的內(nèi)源性物質(zhì)響應(yīng)值非常高，對花椒的入血成分的鑒定存在干擾，故考慮采用多元統(tǒng)計分析，即PCA結(jié)合OPLS-DA分析辨識花椒的血中移行成分。

3.5 多元統(tǒng)計分析

PCA結(jié)果（圖3-A）表明，在正離子模式下，對照組、空白給藥組、模型組及花椒高劑量組大鼠血清輪廓均有一定的分離趨勢，說明各組樣本之間存在差異。在明確了組間差異的基礎(chǔ)上，進一步采用OPLS-DA篩選組間差異成分及代謝產(chǎn)物，如圖3-B所示，對照組與空白給藥組、模型組與花椒高劑量組大鼠血清樣本被分成2個離散群，表現(xiàn)出良好的組間差異。OPLS-DA模型的2＞0.989，2＞0.904，表明所建立的統(tǒng)計模型具有良好的解釋能力和預測能力。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01

表1 花椒提取物對寒邪犯胃型胃脘痛大鼠全血血細胞的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of Zanthoxyli Pericarpium on whole blood cells of rats with epigastric pain caused by cold evil invading (, n = 6)

組別劑量/(mg·kg?1)數(shù)目/(1×109個·L?1) 全血白細胞淋巴細胞中性粒細胞單核巨噬細胞嗜堿性粒細胞 對照—11.96±3.838.59±2.142.78±1.220.56±0.220.032±0.008 模型—4.44±1.68**3.06±1.13**1.00±0.23**0.17±0.05**0.014±0.005* 附子理中丸100010.11±4.59##9.12±4.67##1.83±0.44#0.39±0.13##0.024±0.014 花椒57.67±0.616.25±1.241.67±0.430.29±0.060.014±0.011 108.75±2.42#7.01±0.89#1.75±0.410.38±0.12#0.024±0.009 209.31±2.94#6.94±2.72#1.55±0.380.33±0.06#0.014±0.011

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group

圖2 正離子模式下對照組 (A)、空白給藥組 (B)、模型組 (C) 及花椒高劑量組 (D)大鼠的代表性血清樣品總離子流圖

圖3 正離子模式下各組大鼠血清輪廓的PCA (A)及OPLS-DA (B)圖

3.6 原型成分的鑒定

本課題組前期采用UPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS技術(shù)，通過對照品及文獻報道，對花椒提取物進行成分分析，共鑒定出19個化學成分，主要包括羥基山椒素、花椒素等不飽和脂肪酸酰胺。在花椒血清藥物化學研究中，根據(jù)對照品及各化學成分的保留時間（R）、精確相對分子質(zhì)量和二級質(zhì)譜信息，共檢測出4個原型成分，詳細信息見表2，各化合物相對豐度見圖4。花椒高劑量組中羥基-α-山椒素、羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素氧化產(chǎn)物的相對豐度均高于空白給藥組，而羥基-ε-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的代謝產(chǎn)物相對豐度較低；空白給藥組僅有2個樣本檢測到二羥基-α-山椒素。

化合物H1：正離子模式掃描下，R為16.86 min，檢測到準分子離子峰為302.171 8 [M＋Na]+，計算化合物分子式為C16H25NO3。在二級質(zhì)譜圖中，母離子連續(xù)丟失1分子H2O（18）、C5H9O2N（115）、C3H4（40）、C2H4（28），分別形成碎片離子262.180 1、147.116 3、107.085 5、79.054 6。結(jié)合相關(guān)參考文獻[15]，鑒定化合物H1為二羥基-α-山椒素。

化合物H3：正離子模式掃描下，R為19.34 min，檢測到準分子離子峰為264.195 3 [M＋H]＋，計算化合物分子式為C16H25NO2。在二級質(zhì)譜圖中，母離子連續(xù)丟失1分子H2O（18）和1分子C5H9NO（99），分別形成碎片離子246.184 4、147.116 3；在碎片離子147.116 3基礎(chǔ)上，分別丟失1分子C3H4（40）、1分子C5H8（68），形成碎片離子107.085 5、79.054 6。通過對照品比對及查詢相關(guān)參考文獻[15]，鑒定化合物H3為羥基-α-山椒素，其二級質(zhì)譜圖及其可能裂解途徑見圖5。

表2 花椒的入血成分及代謝產(chǎn)物的鑒定

Table 2 Identification of components and metabolites of Zanthoxyli Pericarpium absorbed in serum

編號tR/min化合物名稱m/z質(zhì)量偏差加和離子分子式 實測值理論值 HM111.79羥基-α-山椒素的氧化產(chǎn)物280.189 9280.190 7?2.86[M＋H]＋C16H25NO3 HM213.07羥基-β-山椒素的氧化產(chǎn)物280.190 1280.190 7?2.14[M＋H]＋C16H25NO3 H116.86二羥基-α-山椒素302.171 8302.172 6?2.65[M＋Na]＋C16H25NO3 H218.88羥基-ε-山椒素*264.195 8264.195 70.38[M＋H]＋C16H25NO2 H319.34羥基-α-山椒素*264.195 3264.195 8?2.65[M＋H]＋C16H25NO2 H419.81羥基-β-山椒素*264.195 1264.195 8?2.65[M＋H]＋C16H25NO2 HM323.57羥基-γ-山椒素的甲基化和乙酰化產(chǎn)物346.330 4346.331 5?3.17[M＋H]＋C20H43NO3

*經(jīng)過對照品比對鑒定

*identified by comparison with reference substances

圖4 各組大鼠血中移行成分的相對豐度

化合物H2、H4：正離子模式掃描下，R分別為18.88、19.81 min，檢測到準分子離子峰為264.195 8、264.195 1 [M＋H]＋，計算化合物分子式為C16H25NO2，其一級和二級質(zhì)譜信息與化合物H3基本相同。通過對照品比對及查詢相關(guān)參考文獻[16]，推測化合物H2、H4分別為羥基-α-山椒素的同分異構(gòu)體羥基-ε-山椒素、羥基-β-山椒素。

3.7 代謝產(chǎn)物的鑒定

通過軟件分析并參考原型成分二級質(zhì)譜信息，進一步鑒定羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的代謝產(chǎn)物，代謝途徑主要包括氧化、甲基化、乙?；磻?yīng)等，詳細信息見表2，化合物相對豐度值見圖4。

化合物HM1、HM2：正離子模式掃描下，R分別為11.79、13.07 min，檢測到準分子離子峰為280.189 9、280.190 1 [M＋H]＋，計算分子式為C16H25NO3，與化合物H3和H4相差16（O），并且出現(xiàn)了化合物H3和H4的特征碎片離子147.116 3、79.054 6、67.054 7，結(jié)合R，推斷HM1、HM2分別為羥基-α-山椒素的氧化產(chǎn)物和羥基-β-山椒素的氧化產(chǎn)物。

化合物HM3：正離子模式掃描下，R為23.57 min，檢測到準分子離子峰346.330 4 [M＋H]＋，計算化合物分子式為C20H43NO3。在二級質(zhì)譜圖中，母離子連續(xù)丟掉1分子CH2（14）與C2H2O（42），形成二級碎片離子290.210 7。還檢測到羥基-γ-山椒素的特征碎片離子57.070 4，推測HM3為羥基-γ-山椒素的甲基化和乙?；a(chǎn)物。

3.8 花椒入血成分潛在靶點的通路注釋及分子對接驗證

通過PharmMapper反向?qū)樱魅胙煞至u基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-ε-山椒素分別匹配到83、93、65個作用靶點。成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果（圖6-A）顯示，各成分作用靶點主要富集在腫瘤通路、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信號通路、Th17細胞分化等信號通路，提示花椒溫中止痛功效與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)有關(guān)，與本實驗結(jié)果互為驗證。

圖5 羥基-α-山椒素的二級質(zhì)譜圖(A) 以及可能的裂解途徑(B)

圖6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖 (A)及成分-靶點結(jié)合模式圖 (B)

選取共同調(diào)控Th17細胞分化與PPAR信號通路的作用靶點進行通路驗證：絲裂原激活蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14，PDB ID 7BDO）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2，PDB ID 4ZF7）、JAK激酶3（Janus kinase 3，JAK3，PDB ID 6GLB）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3，PDB ID 6AQ1）、FABP6（PDB ID 518O）、FABP7（PDB ID 7E25）、視黃酸X受體β（retinoid X receptor beta，RXRB，PDB ID 7A78）。以原配體與蛋白靶點得分為閾值，3個原型成分與FABP3、RXRB、FABP7、JAK3對接的LibDock score值基本一致，分別為87.94、111.87、100.47、103.65，且均高于原配體或與原配體差異不大（83.37、102.20、87.39、103.87）。以羥基-α-山椒素與FABP3、FABP7蛋白靶點對接為例（圖6-B），活性成分與靶點蛋白的氨基酸殘基主要通過氫鍵、碳氫鍵結(jié)合。

4 討論

胃脘痛是以上腹胃脘部近心窩處發(fā)生疼痛為主癥，多伴脘腹痞滿、噯腐吞酸、不思飲食等癥狀的一種常見病證，溫胃散寒、理氣止痛是基本治法之一[17]。寒邪犯胃型胃脘痛多因過食生冷或寒邪直中，損傷脾胃，脾失健運所致，故常見形寒肢冷、毛發(fā)枯槁等癥，故本研究采用ig冰水結(jié)合冰浴法復制大鼠寒邪犯胃型胃脘痛動物模型，發(fā)現(xiàn)大鼠多表現(xiàn)出明顯寒相，表明大鼠的免疫系統(tǒng)等功能受到明顯影響，因此進一步對大鼠全血血細胞計數(shù)及免疫器官指數(shù)進行檢測。結(jié)果顯示，花椒提取物對大鼠白細胞、淋巴細胞、單核巨噬細胞等血細胞計數(shù)及胸腺指數(shù)有明顯提高作用，表明花椒可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮溫中止痛功效。

在血清樣品處理中考察了沉淀劑乙腈和醋酸乙酯的比例，乙腈-醋酸乙酯（2∶3）為沉淀劑時，化合物豐度相對較高，故本實驗使用乙腈-醋酸乙酯（2∶3）沉淀蛋白?？紤]到各成分在體內(nèi)的吸收、消除過程并不一致，為檢測到更多的入血成分，將多時間點的血清樣品混合后進行進樣檢測[18]?？瞻捉o藥組和花椒高劑量組大鼠血清中有6個相同的特征峰，其中包括3個原型吸收成分和3個代謝產(chǎn)物，主要為酰胺類成分，且多數(shù)化學成分在病理狀態(tài)下的入血相對量高于正常組，羥基-ε-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的代謝產(chǎn)物相對豐度較低，這也說明正常和病理狀態(tài)下，動物對于藥物的吸收可能存在明顯的差異，藥物代謝的速率和程度也可能不同[19]，但入血成分的含量變化還需對其進行定量分析才能說明。網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)結(jié)果表明，山椒素成分可以和PPAR信號通路、Th17細胞分化等免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路靶點蛋白良好結(jié)合，這也說明山椒素可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮溫中止痛功效。本研究鑒定出的成分都是花椒中含量比較高的成分，也是主要的風味成分，這可能是花椒溫中止痛功效的潛在活性成分，為Q-Marker的研究提供科學基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on quality markers ofon warming middle-energizer to alleviate pain based on serum medicinal chemistry

ZHANG Meng-meng, WANG Dan, WEI Da-neng, YE Xun, HE Lin, PANG Wen-qiang, PENG Wei, WU Chun-jie

School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

Based on concept of quality marker (Q-Marker) of traditional Chinese medicine, middle-warming and pain- alleviating efficacy of Huajiao () was verified, and then the migration components of its in blood of normal rats and model rats were analyzed.Rat model of epigastric pain caused by cold pathogens invading the stomach was established by ig ice water combined with ice bath, andextract was ig for 2 weeks.Pathological changes were detected, including rats in general, whole blood count, organ index and gastric tissue.UPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS was used to collect the data of serum samples in control group, model group, blank administration group, andhigh-dose group.Principal component and orthogonal partial least squares discriminant method were employed to analyze the potential effective compound ofon effect of middle-warming and analgesic efficacy.Furthermore, protein target of component in blood was screened by reverse docking with PharmMapper, and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis was performed; Component-target-pathway network was constructed; Molecular docking was applied to verify the main pathway.Compared with model group, auricles color of rats ingroup was obviously reddened, and counts of leukocytes, lymphocytes and mononuclear macrophages in blood were significantly increased (< 0.05), and thymus index was increased (< 0.01).Local necrotic exfoliation and cellular denaturation of gastric tissue were reduced.Seven components were identified from serum of rats in blank administration group andhigh-dose group, among which four were prototype components (hydroxy-α-sanshool, hydroxy-β-sanshool, hydroxy-ε-sanshool, dihydroxy-α-sanshool), three of which were metabolites; Among them, dihydroxy-α-sanshool was only present in serum of rats inhigh-dose group.The blood components ofcould bind well to peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) signaling pathway and Th17 cell differentiation-related target proteins of fatty acid binding protein 3 (FABP3), retinoid X receptor β (RXRB), FABP7, Janus kinase 3 (JAK3) through hydrogen bonds.may regulate the immune system through PPAR and Th17 cell differentiation signaling pathways to exert its middle-warming and pain-alleviating effect.Hydroxy-sanshool components can be used as Q-Marker for the effect offor in-depth research.

; warm middle-to alleviate pain; serum pharmacochemistry; quality markers; hydroxy-α-sanshool; hydroxy-β-sanshool; hydroxy-ε-sanshool; dihydroxy-α-sanshool

R285.5

A

0253 - 2670(2022)09 - 2731 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.016

2021-12-22

四川省中醫(yī)藥管理局項目（2020HJZX001）

張萌萌，女，博士研究生，研究方向為中藥炮制與制劑。E-mail: garita119@163.com

通信作者：吳純潔，男，博士，研究員，研究方向為中藥炮制與制劑。E-mail: wcj-one@263.net

彭 偉，男，博士，副教授，研究方向為中藥炮制與制劑。E-mail: pengwei@cdutcm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]