范賢光， 黃彥睿， 劉 龍， 許英杰， 王 昕*

1. 廈門大學(xué)航空航天學(xué)院儀器與電氣系， 福建 廈門 361005

2. 傳感技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 廈門 361005

引 言

近年來， 拉曼成像技術(shù)已成為細(xì)胞內(nèi)成分監(jiān)測、 食品質(zhì)量和食品安全等諸多應(yīng)用領(lǐng)域的首選之一[1-3]。 拉曼成像的主要優(yōu)點(diǎn)是特異性高、 無創(chuàng)、 所需樣品制備少[4-7]。

得益于激光技術(shù)、 濾波器、 光譜儀、 處理算法等相關(guān)配套技術(shù)的快速發(fā)展， 拉曼成像技術(shù)自身也得到了很大的提升[8]。 其中， 處理算法(基線校正[9]、 去噪[10]、 信噪比評估[11]等)的開發(fā)對于在不增加硬件成本的情況下提高拉曼成像設(shè)備的性能具有重要意義。 然而， 現(xiàn)有的處理算法大多集中在拉曼信號上， 雖然圖像處理容易實(shí)現(xiàn)， 但對拉曼成像處理的研究很少。 我們得出的主要結(jié)論是單純在圖像上處理容易導(dǎo)致原始拉曼信息的失真和丟失[12]。 現(xiàn)有的圖像插值算法用于拉曼圖像的處理的過程中， 只單純考慮提取拉曼信號峰值面積/強(qiáng)度后每個(gè)像素點(diǎn)的值而忽略了拉曼散射的物理特性， 如最近鄰插值算法[13]、 雙線性插值算法[14]。 然而， 選擇合適的圖像插值算法對于拉曼成像來說是有意義的， 操作員可以在一定程度上獲得更高空間分辨率的拉曼圖像， 略微突破硬件的限制； 同時(shí)縮短拉曼掃描時(shí)間， 有利于觀察活性組織動(dòng)態(tài)過程。

為此， 本文提出了一種基于Voigt函數(shù)的拉曼成像插值算法(VFI)， 該算法考慮了原始測量的拉曼信號對拉曼圖像的影響： 首先， 利用數(shù)學(xué)模型(Voigt函數(shù))對測量的拉曼信號在每個(gè)采集點(diǎn)選定的峰值區(qū)間進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合， 并提取Voigt函數(shù)的特征參數(shù)； 然后， 利用相鄰Voigt函數(shù)的參數(shù)計(jì)算新插值點(diǎn)Voigt函數(shù)的特征參數(shù)， 從而建立新插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)； 最后， 通過計(jì)算其Voigt函數(shù)的譜峰面積/強(qiáng)度得到新像素的值， 最后合成所有像素點(diǎn)的信息達(dá)到提高拉曼成像空間分辨率的目的。 經(jīng)過這些處理步驟后， 可以盡可能地保留被測拉曼信號的原始組分分布情況， 避免不必要的錯(cuò)誤信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 拉曼成像的插值算法流程

在采集原始樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)后， 采用Voigt函數(shù)對已知數(shù)據(jù)點(diǎn)的成像峰利用Voigt函數(shù)進(jìn)行最小二乘擬合然后提取原始數(shù)據(jù)的特征參數(shù)作為插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)的特征參數(shù)， 構(gòu)建插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)， 最后將原始數(shù)據(jù)與插值點(diǎn)結(jié)合生成拉曼圖像。 其原理如圖1所示。

拉曼成像插值方法的基本步驟如下：

(1) 加載采集的光譜數(shù)據(jù)， 對鬼峰平滑處理以消除成像的不良影響， 并確定待成像組分， 即確定拉曼位移區(qū)間。

(2) 對已知原始數(shù)據(jù)的成像峰采用Voigt函數(shù)通過進(jìn)行最小二乘擬合得到解析譜峰的特征參數(shù)(Voigt函數(shù)原理見下一節(jié))。

(3) 從step2提取出已知數(shù)據(jù)的Voigt函數(shù)的特征參數(shù)后， 利用線性插值方法計(jì)算新插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)的參數(shù)。 一般情況下， 在兩個(gè)已知點(diǎn)之間只插入一個(gè)點(diǎn)(見下一節(jié)插值方法)， 所以線性插補(bǔ)是合理且足夠的。

(4) 根據(jù)step3求出的參數(shù)， 構(gòu)建插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)。

(5) 計(jì)算新插值點(diǎn)的值(Voigt函數(shù)的譜峰面積/強(qiáng)度)， 結(jié)合原始數(shù)據(jù)和新插值點(diǎn)數(shù)據(jù)合成新的拉曼圖像， 提高拉曼圖像的空間分辨率。

1.2 插值方法

本節(jié)我們推薦兩種插值策略模式， 行插值(模式1)和點(diǎn)插值(模式2)。 如圖2所示， 在模式1中， 兩個(gè)黑點(diǎn)a和c插值得到中間橙色點(diǎn)b， 因此在模式1中插值后圖像的行數(shù)約等于原始圖像的兩倍。 在模式2中， 利用周圍的四個(gè)黑點(diǎn)插值得到中間橙色點(diǎn)d， 因此插值后圖像的行數(shù)和列數(shù)約等于原始圖像兩倍， 即假設(shè)原始拉曼圖像的空間分辨率為m×n， 從圖2可以看出， 模式1下的空間分辨率可以提高到(2m-1)×n， 模式2下的空間分辨率可以提高到(2m-1)×(2n-1)， 這意味著增加了約50%和75%的點(diǎn)。 理論上， 在兩個(gè)已知點(diǎn)之間可以插入任意數(shù)量的點(diǎn)， 但不建議添加過多的點(diǎn)。

圖2 VFI插值策略

拉曼光譜峰的線形本質(zhì)上是洛倫茲線形， 由于受儀器或樣品特性的影響， 譜峰的線形可以表述為高斯函數(shù)和洛倫茲函數(shù)的卷積類型， 即Voigt函數(shù)。 Voigt函數(shù)沒有解析解， 只能用數(shù)值描述。 Wertheim提出了Voigt函數(shù)的近似表示

(1)

式(1)僅擬合成像的拉曼特征峰而未考慮熒光背景的影響， 因此， 將其熒光背景近似為直線， 并結(jié)合Voigt函數(shù)形成數(shù)學(xué)模型為

W(V，k，v，b)=V(v，α，w，γ，θ)+kv+b

(2)

式(2)中， 特征參數(shù)共有6個(gè)，v表示拉曼位移值，α為特征峰的最大值強(qiáng)度，w表示特征峰的最大值對應(yīng)的拉曼位移值，γ為半峰全寬，θ(0≤θ≤1)為高斯-洛倫茲系數(shù)，k為熒光背景基線斜率θ(0≤θ≤1)，b為熒光背景的縱截距。

圖3是利用Voigt函數(shù)對原始數(shù)據(jù)插值情況的示意圖， 其中圖3(a)和(b)分別是相鄰兩個(gè)樣品采集數(shù)據(jù)1和2利用Voigt函數(shù)擬合情況示意圖(黑色k線為采集點(diǎn)去除鬼峰后的光譜數(shù)據(jù))， 圖3(c)是根據(jù)點(diǎn)1和2的Voigt函數(shù)利用線性插值得到的插值點(diǎn)的擬合情況示意圖。

圖3 模式1中利用鄰近點(diǎn)擬合插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)的原理

圖像插值算法最可能出現(xiàn)的問題是圖像的過度失真和信息丟失。 因此， 本文引入了直方圖相似度和結(jié)構(gòu)相似度算法(SSIM)， 通過這兩個(gè)數(shù)學(xué)指標(biāo)來評價(jià)插值后拉曼圖像效果。 在實(shí)驗(yàn)部分， 我們將用不同掃描間隔得到的拉曼圖像通過行插值和列插值， 通過這兩個(gè)指標(biāo)可以對插值圖像與分辨率最高的測量圖像進(jìn)行比較來評價(jià)圖像的相似度。

1.3 材料和測試儀器

以頭孢呋辛酯(藥品1)、 人宮頸癌細(xì)胞(細(xì)胞1)作為檢測樣本。 拉曼成像設(shè)備采用由日本Nanophoton 公司研發(fā)的Raman 11成像系統(tǒng)進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)條件的詳細(xì)信息請參考文獻(xiàn)[8]。 4種實(shí)驗(yàn)樣品采用的拉曼成像峰分別為247， 539， 116和247 cm-1。

(a)： Voigt function of point 1; (b)： Voigt function of point 3;

(c)： Voigt function of point 2

拉曼成像采用日本Nanophoton Raman 11儀器， 掃描方式為線掃描(每行400個(gè)點(diǎn)， 像素點(diǎn)間距為2 μm)， 掃描步長2 μm。 采用激光功率為0.1 mW·μm-2的785 nm激光線、 NA(數(shù)值孔徑)為0.45的50個(gè)空氣顯微鏡物鏡和600 grooves·mm-1光柵進(jìn)行測量。 采用不同的掃描時(shí)間獲得不同質(zhì)量的拉曼圖像。

2 結(jié)果與討論

圖4和圖5展示了在兩種模式下藥品1和細(xì)胞1的采集點(diǎn)待插值拉曼圖像、 VFI單行/單點(diǎn)插值圖像和與VFI圖像對比的采集點(diǎn)高分辨率拉曼圖像。 待插值拉曼圖像圖4(a， d)和圖5(a，d)由于掃描分辨率低導(dǎo)致圖像模糊、 顆粒狀明顯， 但是經(jīng)過單行/單點(diǎn)插值處理后， 圖4(b，e)和圖5(b，e)的視覺質(zhì)量得到了改善， 變得更加平滑和精細(xì)。 因此， 對采集點(diǎn)待插值拉曼圖像通過VFI插值后[圖4(b，e)和圖5(b，e)]與采集點(diǎn)對比圖像[圖4(c，f)和圖5(c，f)]相比， 相似度較高， 組分分布情況相似。 而在圖5(a，d)(模式2)中， 待插值拉曼圖像的分辨率遠(yuǎn)低于圖4(a，d)(模式1)， 組分分布信息也得到了很好的保存。

圖6顯示了該插值方法在兩種模式下藥品1和細(xì)胞1插值后的拉曼成像和相同分辨率的采集圖像的復(fù)合直方圖[如圖4(b和c)， (e和f)]， 結(jié)果顯示直方圖的重合度較高。

圖4 模式1中藥品1和細(xì)胞1的實(shí)驗(yàn)對比圖像

圖5 模式2中藥品1和細(xì)胞1的實(shí)驗(yàn)對比圖像

圖6 兩種模式下藥品1和細(xì)胞1的插值一行/一點(diǎn)后拉曼圖像與同分辨率采集圖像的復(fù)合直方圖

表1為兩種模式下不同實(shí)驗(yàn)樣品插值后的拉曼圖像和高空間分辨率圖像的直方圖歐幾里得距離[15]和SSIM結(jié)果， 歐幾里得距離越接近于0意味著直方圖相似度較高， 圖中四種樣品的SSIM值均大于等于0.9， 意味著VFI的效果是可靠的(SSIM的值從0到1， 1意味著相似性最高； 0意味著相似性最差)。 因此， 從圖6和表1可以看出， 本文提出的VFI算法不會(huì)對原始圖像產(chǎn)生過度的失真， 并且盡可能地保留了信息。

表1 兩種樣品的直方圖歐幾里得距離和SSIM值

本文所提出的數(shù)學(xué)方法理論上可以在圖像上添加任意整數(shù)個(gè)數(shù)的點(diǎn)。 因此， 為了進(jìn)一步觀察VFI的效果， 我們將圖4(a)和(d)中的低空間分辨率圖像在模式1中， 在兩個(gè)已知行之間添加3、 7行進(jìn)行插值。 如圖7所示， 增加更多的點(diǎn)并沒有明顯改善圖像質(zhì)量， 但計(jì)算成本成倍增加。 事實(shí)上， 圖7(a)， (b)和圖4(b)幾乎是一樣的， 圖7(c)， (d)和圖4(e)也是一樣的。 因此， 在原始圖像上添加太多的點(diǎn)是沒有意義的。

圖7 藥品1和細(xì)胞1在模式1下不同插值數(shù)量下VFI插值后的拉曼圖像

除了討論了VFI算法的優(yōu)點(diǎn)外， 還需要考慮算法的一些注意事項(xiàng)。 在拉曼成像中最需要考慮的仍然是掃描間隔(行和列)， 如果這些參數(shù)選擇不當(dāng)， 所提出的VFI也不能達(dá)到很好的效果。 在圖8中， 我們在比圖4(a)和(d)更大的線掃描間距下掃描藥品1和細(xì)胞1， 利用模式1對測量圖像進(jìn)行插值， 嘗試獲得較好的成像效果。 顯然， 要獲得與高分辨率測量圖像[圖4(c)和(f)]相同的效果是完全不可能的。 而且， 在某些情況下， 如果某個(gè)分量的分布面積很小， 就會(huì)丟失分量信息。 圖9為其中一例： 在細(xì)胞原始拉曼圖像[圖9(a)]中， 紅色圈內(nèi)為組分高濃度區(qū)(僅一行)； 加大一倍行掃描間隔采集到的拉曼圖像丟失了高濃度區(qū)域[圖9(b)]， 由于該處的組分信息已丟失， 因此插值后的圖像仍然會(huì)丟失該點(diǎn)的真實(shí)組分濃度[圖9(c)]。 理論上， 需要選擇好掃描間隔， 避免遺漏重要的組分濃度信息。

圖8 模式1下藥品1和細(xì)胞1在不同掃描間隔以及插值后的拉曼圖像

圖9 組分信息丟失示意圖

3 結(jié) 論

為了提高拉曼成像的空間分辨率， 我們提出了一種簡便易行的拉曼成像插值方法， 該方法采用Voigt函數(shù)對已知原始數(shù)據(jù)光譜的拉曼峰進(jìn)行最小二乘擬合。 該方法能很好地將譜峰轉(zhuǎn)化為數(shù)學(xué)模型， 便于建立插值點(diǎn)的Voigt函數(shù)。 然后， 對高分辨率測量圖像和相同分辨率的插值圖像的相似性分析表明， 所提出的VFI不僅在圖像視覺感官上， 而且在數(shù)學(xué)指標(biāo)上都是有效和可靠的。 最后， 我們描述了VFI的注意事項(xiàng)。 它可以作為拉曼成像數(shù)據(jù)處理和軟件的有效補(bǔ)充。