侯冰茹， 劉鵬輝， 張 洋， 胡耀華， 2， 3*

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機械與電子工程學(xué)院， 陜西 楊凌 712100

2. 陜西省農(nóng)業(yè)信息感知與智能服務(wù)重點實驗室， 陜西 楊凌 712100

3. 浙江農(nóng)林大學(xué)光機電工程學(xué)院， 浙江 杭州 311300

引 言

馬鈴薯是糧菜兼用型作物， 也是僅次于小麥、 水稻、 玉米的世界第四大糧食作物。 在我國馬鈴薯主要種植區(qū)， 由致病疫霉侵染引起的晚疫病是馬鈴薯產(chǎn)量的毀滅性病害， 也是所有引起產(chǎn)量損失的病害中最嚴(yán)重的一種卵菌性病害[1]。 該病在馬鈴薯整個生育期均可發(fā)生， 嚴(yán)重時可導(dǎo)致馬鈴薯絕收。 因此研究馬鈴薯晚疫病害的發(fā)生及流行時期預(yù)測對馬鈴薯晚疫病害的防治具有重要意義。

近年來光譜技術(shù)由于其分析迅速、 不破壞樣品、 不消耗化學(xué)試劑、 不污染環(huán)境等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害無損檢測領(lǐng)域中。 光譜技術(shù)結(jié)合圖像處理、 化學(xué)計量學(xué)方法和與病害有關(guān)的一些理化參數(shù)可實現(xiàn)對農(nóng)作物病害的早期檢測， 并達(dá)到了很好的效果。 其中結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可實現(xiàn)對農(nóng)作物病害的發(fā)病程度的定性分類判別， 如程術(shù)希等[2]采用偏最小二乘回歸(partial least square regression， PLSR)算法對不同水稻稻葉瘟染病程度的葉片進行化學(xué)計量學(xué)分析， 建立了稻葉瘟染病程度檢測模型， 利用光譜技術(shù)可實現(xiàn)病害脅迫下農(nóng)作物葉片的各種酶活性等理化值的預(yù)測， 如程帆[3]等實現(xiàn)了細(xì)菌性角斑病早期脅迫下黃瓜葉片中過氧化物酶活性的測定， 楊燕等[4]通過建立基于光譜信息的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)預(yù)測模型反演出水稻稻瘟病潛育期內(nèi)的SOD酶活性， 胡耀華等[5]利用高光譜技術(shù)建立了基于X-LW-PLS的定量模型用以預(yù)測馬鈴薯晚疫病葉片中過氧化物酶的活性。 這些研究側(cè)重于不同程度病害脅迫下作物各種理化值的預(yù)測和變化規(guī)律的研究， 未能將理化值的變化規(guī)律同病害發(fā)病機理結(jié)合以實現(xiàn)染病程度的定性預(yù)測。

過氧化物酶(peroxidase， POD)是一種用于評價植物抗逆性的酶， 其在植物染病期間是不斷變化的， 并與植物患病程度直接相關(guān)。 Li[6]等建立了晚疫病脅迫下不同種類馬鈴薯葉片POD酶活性相對于患病時間的五階模型， 證明了利用POD酶活性反演晚疫病害程度的可行性。 因此先利用葉片的光譜信息實現(xiàn)對POD酶活性的定量預(yù)測， 再利用預(yù)測的POD酶活性進而實現(xiàn)對馬鈴薯晚疫病害的定性預(yù)測是可行的。

本研究以不同患病程度的馬鈴薯葉片為研究對象， 利用光譜對不同溫濕度條件下的馬鈴薯葉片的POD酶活性進行快速測定， 研究POD酶活性隨患病程度變化的規(guī)律， 實現(xiàn)基于POD酶活性的馬鈴薯晚疫病患病程度的定性預(yù)測， 對野外馬鈴薯晚疫病害的早期檢測和防治及便攜式檢測儀的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試驗材料

選用“隴薯1號”種薯， 其屬晚疫病中感品種， 廣泛種植于西北地區(qū)。 于2020年1月種植于楊凌現(xiàn)代示范農(nóng)業(yè)園區(qū)溫室大棚內(nèi)， 以盆栽方式培養(yǎng)。 在馬鈴薯生長后期(開花末期)采集若干片健康狀況良好、 大小一致的馬鈴薯葉片接種致病疫霉， 圖1為接菌后的馬鈴薯葉片， 接種后用保鮮膜將放置葉片容器密封保濕， 置于溫度為(17±1) ℃的人工氣候培養(yǎng)箱(RGX-250B， 上海坤天實驗室儀器有限公司， 中國)中培養(yǎng)24 h以確保侵染成功。 由于馬鈴薯晚疫病害流行的最適宜溫度為16～24 ℃、 適宜的發(fā)病濕度為85%以上， 為模擬不同馬鈴薯晚疫病害發(fā)生的環(huán)境條件， 因此分別設(shè)置15， 20和25 ℃的溫度梯度及70%， 80%和90%的濕度梯度。 將葉片隨機分為9組， 每組15片， 將9組葉片分別放入不同溫濕度條件的培養(yǎng)箱中進行為期5天的離體培養(yǎng)， 圖2為在溫度為20 ℃、 濕度為70%的環(huán)境條件下經(jīng)1～5 d培養(yǎng)后的馬鈴薯葉片圖像。

圖1 接菌后的離體馬鈴薯葉片

圖2 溫度為20 ℃、 濕度為70%環(huán)境條件下培養(yǎng)的第1～5天的葉片圖像

1.2 光譜采集

為避免樣品溫度對光譜反射率的影響， 在同一室溫條件下對葉片進行光譜采集。 采用如圖3所示的波長范圍為350～1 000 nm的可見光/近紅外光纖光譜儀(USB4000， Ocean Optics， Dunedin， Florida， USA)并結(jié)合便攜式反射探頭(PRB-D0-IS30， 江陰韻翔光電技術(shù)有限公司， 中國)對馬鈴薯葉片光譜采集。 選擇病斑部位作為感興趣區(qū)域， 使用探頭垂直照射葉片病斑部位表面， 將三次重復(fù)測量的感興趣區(qū)域部位的光譜反射率的平均值作為樣本的光譜反射率。

圖3 光譜采集系統(tǒng)

1.3 POD酶活性測定

剪取葉片的感興趣區(qū)域部位， 對其利用分光光度法實現(xiàn)POD酶活性的測定， 采用酶標(biāo)儀(YMB-7A， 廈門億恩達(dá)儀器設(shè)備有限公司， 中國)進行吸光值的測定， 每隔1 min記錄其在470 nm處的吸光值， 共記錄3次， 以每分鐘吸光值變化0.01定義為一個酶活性單位， 計算POD酶活性[7]。

1.4 化學(xué)計量學(xué)建模方法

圖4 異常樣本檢測結(jié)果

表1 馬鈴薯葉片POD酶活性統(tǒng)計結(jié)果

1.5 數(shù)據(jù)處理軟件

利用SpectraSuite(Ocean Optics， USA)軟件實現(xiàn)對光譜的采集； 利用The Unscrambler X(CAMO， Norway)軟件進行光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理； 利用MATLAB(MathWorks， USA)軟件實現(xiàn)了數(shù)據(jù)劃分、 異常樣本檢測、 PLS模型建立、 評估及特征波長的提取。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬鈴薯葉片光譜曲線及POD酶活性變化規(guī)律分析

光譜儀的波長測量范圍為350～1 000 nm， 由于受環(huán)境和儀器噪聲的影響， 350～480和950～1 000 nm波段范圍內(nèi)反射率變化波動較大， 因此選擇480～950 nm波段的光譜數(shù)據(jù)進行分析。 圖5為不同接菌時間的馬鈴薯葉片光譜曲線。 550 nm處的反射率與葉綠素含量有關(guān)， 近紅外波段的反射率與細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)， 隨著接菌時間的增加， 葉片內(nèi)葉綠素含量降低， 葉片細(xì)胞壁被破壞、 細(xì)胞空隙變大， 導(dǎo)致550 nm處和近紅外波段的光譜反射率隨接菌時間的增加而減小。 并且隨著接菌時間的增加， 760 nm波長附近由于水或氧的窄吸收帶導(dǎo)致的微弱波谷[9]發(fā)生了左移。

圖5 不同接菌時間時的馬鈴薯葉片光譜曲線

通過分析圖2中接菌后第1～5 d的馬鈴薯葉片圖像可知， 接菌1 d時葉片無明顯變化， 2 d時葉片出現(xiàn)褐色斑點， 隨著接菌時間的增加， 褐色斑點迅速向外擴大， 在4 d時病斑產(chǎn)生白霉， 此后病斑擴大速率降低， 其與馬鈴薯葉片染病的基本癥狀基本一致， 在本研究的實驗條件下認(rèn)為接菌后0～1 d為染病初期、 1～4 d為染病中期、 4～5 d為染病后期。 圖6和圖7分別為不同溫度、 濕度條件下POD酶活性隨接菌時間的變化， 從圖中可看出不同溫濕度環(huán)境條件下POD酶活性隨接菌時間變化的趨勢較明顯， 其大致呈先降后升再降的趨勢， 且POD酶活性均在第1天達(dá)到最小值、 在第4天達(dá)到最大值。 這與植物體內(nèi)防御系統(tǒng)有關(guān)， 染病初期POD酶活性下降是由于病菌擾亂了植株體內(nèi)的代謝平衡， 之后酶活性升高是由于當(dāng)處于染病中期時植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的POD酶來清除病菌造成的活性氧傷滬， 隨著染病程度的不斷增加， 植物防御失敗導(dǎo)致植物葉片細(xì)胞壁被破壞， 酶活性也隨之降低[10]。

圖6 同一濕度不同溫度條件下POD酶活性隨接菌時間的變化情況

但溫濕度同樣對POD酶活性變化產(chǎn)生影響， 從圖6可看出控制濕度條件相同、 溫度條件不同時， 不同溫度條件下POD酶活性變化速率并不一致， 當(dāng)葉片分別處于染病初期、 中期及后期時， 對應(yīng)20， 25和15 ℃條件下POD酶活性變化相對劇烈。 從圖7可看出控制溫度條件相同、 濕度條件不同時， 當(dāng)葉片分別處于染病初期、 中期及后期時， 對應(yīng)90%， 70%和80%濕度條件下POD酶活性變化相對劇烈。 這說明馬鈴薯晚疫病害在不同染病階段的較適宜的患病流行條件也不相同， 但溫濕度對POD酶活性變化影響的強弱還需進一步建模討論。

圖7 同一溫度不同濕度條件下POD酶活性隨接菌時間的變化情況

通過上述分析可知， 光譜反射率和POD酶活性都會以一定規(guī)律隨患病程度變化 ， 說明POD酶活性與光譜反射率具有一定的相關(guān)關(guān)系， 通過采集葉片的光譜信息可實現(xiàn)對POD酶活性的定量檢測。

2.2 POD酶活性預(yù)測模型建立

2.2.1 光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

用光譜儀所獲取的數(shù)據(jù)不僅包括樣本的成分信息， 還包括儀器噪聲、 雜散光、 背景信息、 基線漂移等無關(guān)信息， 因此光譜數(shù)據(jù)應(yīng)先進行預(yù)處理以建立穩(wěn)定可靠的數(shù)學(xué)模型。 采用了中心化(mean centering, MC)、 歸一化(normalization)、 S-G卷積平滑(Savitzky-Golay smoothing)、 移動窗口平均平滑(moving average smoothing)、 多元散射校正(multiplicative scatter correction， MSC)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation， SNV)、 基線漂移(baseline)、 導(dǎo)數(shù)算法(derivative)等八種預(yù)處理方法對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。 表2為不同預(yù)處理方法所建立的全波長光譜數(shù)據(jù)PLS模型效果， 其中參與建模的變量數(shù)是通過多次建模測試得出， 具體做法為： 參與PLS建模的變量數(shù)從1開始逐漸增加， 利用留一交叉驗證建立PLS模型， 當(dāng)求得的預(yù)測集的誤差均方根最小時， 以此時的參與PLS建模的變量數(shù)為最終參與PLS建模的變量數(shù)。 從表2可以看出， 利用二階導(dǎo)數(shù)算法處理后的數(shù)據(jù)所建立的模型的建模和預(yù)測效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于其他模型， 這是由于經(jīng)二階求導(dǎo)后的導(dǎo)數(shù)光譜與實際相比存在較大誤差， 使得參與建模的變量數(shù)大大降低， 導(dǎo)致模型效果變差。 經(jīng)中心化和基線漂移處理后， 模型的效果提升， 比較來看， 經(jīng)中心化處理后的數(shù)據(jù)所建立的模型的建模集和預(yù)測集的均方根誤差相差較小， 模型穩(wěn)定性相對較好， 因此選擇中心化方法對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。

表2 不同預(yù)處理方法所建立的全波長光譜數(shù)據(jù)PLS模型結(jié)果

2.2.2 特征波長提取

由于光譜數(shù)據(jù)波段較多(采集的有效波長為2 457個)， 大量數(shù)據(jù)不僅增加建模復(fù)雜程度， 并且其中包含的大量冗余和共線性數(shù)據(jù)會影響建模精度[11]， 因此采用了隨機青蛙算法(random frog， RF)、 連續(xù)投影算法(successive projections algorithm， SPA)、 競爭自適應(yīng)加權(quán)算法(competitive adaptive reweighted sampling， CARS)對特征波長進行提取。

RF算法[12]通過計算每個變量的被選概率來評價變量的重要性， 由于該算法是基于隨機抽樣提出的， 每次運行結(jié)果可能會出現(xiàn)差異， 為減少隨機因素的影響， 將RF算法運行100次。 由于利用RF算法無法得出合適的特征波長數(shù)， 因此取運行100次后概率平均值大的前16個波長為特征波長。

SPA算法在數(shù)據(jù)矩陣中應(yīng)用變量投影操作尋找含有冗余信息最低、 共線性最少的光譜特征變量組[13]。 在使用SPA算法提取特征波長時將變量數(shù)范圍放大到了30， 即最多可能選擇30個特征波長點。 圖8為模型的均方根誤差隨變量數(shù)變化的趨勢， 圖9為利用SPA算法提取的特征波長分布情況， 從圖8中可看出隨著變量數(shù)的增加， 模型的均方根誤差呈先降低再升高的趨勢， 當(dāng)變量數(shù)為21時模型的均方根誤差最小， 因此利用SPA算法提取的最佳特征波長數(shù)目為21。

圖8 模型均方根誤差隨變量數(shù)變化的趨勢

圖9 特征波長分布情況

CARS算法能夠選擇出PLS模型中相關(guān)系數(shù)較大的波長， 并利用交叉驗證逐步選擇出均方根誤差最小的子集， 該子集里的變量即為被選擇的波長變量[14]。 同SPA算法相同， 設(shè)置其參與建模的潛在變量數(shù)為30， 共運行100次。 圖10為CARS算法運行結(jié)果， 圖10(a)可看出隨運行次數(shù)增加被選擇的變量數(shù)在逐步減小， 運行次數(shù)和變量數(shù)大致呈指數(shù)關(guān)系， 從圖10(b)中可看出當(dāng)運行次數(shù)為40時， 均方根誤差達(dá)到最小值。 最終利用CARS算法所提取的最佳特征波長數(shù)目為72。 各算法提取的特征波長如表3所示， 分析表3可知利用三種算法提取的特征波長在可見光區(qū)域和近紅外區(qū)域均有分布， 且在可見光區(qū)域集中在綠光波段(492～577 nm)和紅光波段(622～760 nm)， 說明POD酶活性對綠光波段和紅光波段較為敏感。

表3 各算法提取的特征波長

圖10 CARS算法運行結(jié)果

2.2.3 模型對比

建立了基于全波長和各方法提取的特征波長的POD酶活性的預(yù)測模型， 各模型結(jié)果如表4所示。 由表4可看出， 利用RF和SPA算法所建立的模型的建模效果均變差， 可能是由于參與建模波長數(shù)目大大減小而導(dǎo)致的一些有效光譜信息被刪除所引起的； 但用SPA和CARS算法所建立的模型的預(yù)測效果均和原始模型相當(dāng)。 三種算法比較來看， 利用CARS算法所建立模型的建模集和測試集的決定系數(shù)最大、 均方根誤差最小， 其建模效果最好， 因此利用CARS算法來進行特征波長的提取效果最好。

表4 基于特征波長和全波長的PLS模型結(jié)果

2.3 基于POD酶活性的患病程度預(yù)測

由于POD酶活性受溫濕度和患病程度的影響， 利用多元線性回歸分析和徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(radial basis function neural network, RBFNN)建立了POD酶活性的動力學(xué)模型， 模型中晚疫病患病程度用數(shù)字0～3表示， 數(shù)字越大表明其患病程度越嚴(yán)重， 將POD酶活性及溫濕度作為輸入， 輸出為晚疫病患病程度， 且為消除不同量綱的影響， 需對輸入?yún)?shù)進行歸一化處理。 利用多元線性回歸分析建模時， 通過對數(shù)據(jù)歸一化、 散點圖分析、 線性回歸分析后， 篩選出與POD酶活性有顯著關(guān)系的自變量， 建立的POD酶活性動力學(xué)模型如式(1)

y=-0.777t-1.561h+1.407d+4.896th2-3.396t2h2-3.651h2d+7.75h2d2-5.007h2d3+0.8

(1)

式(1)中，y為POD酶活性， 單位U·(g·min)-1；t為溫度， 單位℃；h為濕度， 單位%；d為患病程度， 值取0～3。

利用該模型對30個樣本的患病程度預(yù)測結(jié)果如圖11(a)所示， 其中4個健康樣本被預(yù)測為患病樣本， 預(yù)測準(zhǔn)確率為86.7%。 利用RBFNN網(wǎng)絡(luò)建模時， 以歸一化處理后的120個樣本為輸入樣本， 其中50%為訓(xùn)練樣本， 25%為測試樣本， 25%為驗證樣本， 不斷修改網(wǎng)絡(luò)參數(shù)以提高模型精度。 模型結(jié)果顯示同溫度相比， 濕度對POD酶活性的影響較大。 以圖11(b)所示的混淆矩陣評價模型對30個樣本的預(yù)測結(jié)果， 有3個樣本預(yù)測的患病程度偏嚴(yán)重， 預(yù)測準(zhǔn)確率為90.0%， 可能是用于測試的葉片生長狀況不一， 部分葉片稍許老化， 老化的葉片POD酶活性較正常葉片高， 使得酶活性預(yù)測誤差偏高， 降低了模型準(zhǔn)確率。

圖11 利用多元線性回歸分析(a)和RBFNN(b)建立的模型對樣本患病程度的預(yù)測結(jié)果

3 結(jié) 論

利用光譜對馬鈴薯葉片POD酶活性進行預(yù)測， 比較了多種光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理及特征波長提取方法對預(yù)測模型精度的影響， 再結(jié)合徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)RBFNN實現(xiàn)了基于POD酶活性的馬鈴薯晚疫病患病程度的預(yù)測。 主要結(jié)論如下：

(2) POD酶活性隨患病程度變化的規(guī)律并非呈單調(diào)線性趨勢。 隨著接菌時間的增加， POD酶活性大致呈先降后升再降的趨勢， 說明POD酶活性的變化可以反映馬鈴薯葉片的患病程度。

(3) 基于馬鈴薯葉片的光纖光譜信息實現(xiàn)了晚疫病患病程度的定性預(yù)測。 利用RBF徑向基網(wǎng)絡(luò)建立了POD酶活性和患病時間、 溫濕度的動力學(xué)模型， 其中溫度對POD酶活性變化的影響最小、 接菌時間對其影響最大， 結(jié)合POD酶活性預(yù)測模型即可實現(xiàn)對患病程度的預(yù)測， 預(yù)測準(zhǔn)確率為90.0%， 說明基于POD酶活性對馬鈴薯晚疫病患病程度的定性預(yù)測是可行的， 對野外馬鈴薯晚疫病害的早期檢測和防治及便攜式檢測儀的研制提供了科學(xué)參考。