陳 怡 劉文華 王 莉 歐 洋 韓 雪 閔冬雨

治未病臍貼是作用于神闕穴的外治藥物[1]，組成為：大黃、龍眼肉、花椒、艾葉以上4味，屬深褐色的丸劑，有香氣。大黃味苦，性寒，入胃、大腸、肝經(jīng)；龍眼肉味甘，性溫，歸心、脾經(jīng)；花椒味辛，性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)；艾葉味辛、苦，性溫，歸肝、脾、腎經(jīng)。諸藥苦寒甘溫共濟(jì)，斡旋司斯，共奏理中之效[2]。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研發(fā)創(chuàng)立，應(yīng)用多年臨床療效顯著，為保證其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》[3](以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)各項(xiàng)相關(guān)規(guī)定，最終選用以大黃中的游離蒽醌和總蒽醌[4]的含量作為測(cè)定指標(biāo)，用于控制本制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明此法可用于治未病臍貼的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑ZF-I型三用紫外分析儀 (上海顧村電光儀器廠)，Agilent 1100液相色譜儀，Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。樣品及對(duì)照藥材、蘆薈大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品、土大黃苷、艾葉對(duì)照藥材、桉油精對(duì)照品、桂圓對(duì)照藥材、花椒對(duì)照藥材均來(lái)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心。

1.2 定性鑒別

1.2.1 顯微鏡法取本品5 g，置離心管中，加50～60 ℃熱水50 ml，振搖，使藥物混懸，置離心機(jī)離心，傾去上清液，沉淀再加熱水30 ml，振搖，離心，反復(fù)2次，得離心沉淀物，水浴蒸干，置顯微鏡下觀察：外果皮細(xì)胞垂周壁連珠狀增厚(花椒)；T型非腺毛，頂端細(xì)胞長(zhǎng)而彎曲，兩臂不等長(zhǎng)，柄2～4細(xì)胞，單列性非腺毛，3～5細(xì)胞，頂端細(xì)胞特長(zhǎng)而扭曲，常斷落；腺毛表面管鞋底行，由4～6細(xì)胞相對(duì)疊合而成，無(wú)柄(艾葉)；草酸鈣簇晶(大黃、花椒)。見(jiàn)圖1。

注：A.非腺毛；B.腺毛；C.腺毛；D.草酸鈣簇晶和內(nèi)果皮細(xì)胞；E.外果皮細(xì)胞。

1.2.2 薄層色譜法(TLC)取本品3 g，剪碎，加乙酸乙酯30 ml，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml溶解，作為供試品溶液[5]。另取龍眼肉對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。對(duì)照薄層色譜法(通則0502)[6]實(shí)驗(yàn)，吸取上述2種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開(kāi)劑、展開(kāi)、取出、晾干置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

注：1.對(duì)照藥材溶液；2.供試品溶液；3.陰性液。

1.3 大黃游離蒽醌的高效液相色譜含量測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以甲醇-0.1%磷酸溶液(65∶35),檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。流速1.0 ml/min。柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)≥3000，分離度≥1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80 μg，大黃素甲醚40 μg溶液；分別精密量取上述對(duì)照品溶液各2 ml，混勻，即得(每1 ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16 μg，大黃素甲醚8 μg)。見(jiàn)圖2。

1.3.3 供試品溶液制備方法對(duì)比直接回流提取法、浸泡過(guò)夜后回流提取法和加適量硅藻土分散回流提取法后，選取含量準(zhǔn)備、操作精當(dāng)?shù)牡?種方法，取本品適量，剪碎，取約25 g，精密稱定，置塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，稱定重量，放置過(guò)夜后，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻、濾過(guò)取續(xù)濾液即得供試品溶液。

1.3.4 陰性液干擾實(shí)驗(yàn)取方中除大黃外的各藥材，按制備工藝制成樣品，再按“1.3.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備成缺大黃陰性液。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性液各10 μl注入液相色譜儀，繪制液相色譜圖，結(jié)果在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性液在此峰位無(wú)吸收。見(jiàn)圖2。

1.3.5 線性范圍考察按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，得回歸方程為：蘆薈大黃素Y=47774.409X-4.429，r=0.9998，進(jìn)樣量在0.03125～0.5 μg內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃酸Y=43075.564X-1.258，r=0.9999，進(jìn)樣量在0.036375～0.582 μg內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素Y=34449.900X-0.771，r=0.9998，進(jìn)樣量在0.036875～0.59 μg內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃酚Y=53092.288X-1.217，r=0.9999，進(jìn)樣量在0.04075～0.652 μg內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素甲醚Y=35530.975X-6.363，r=0.9999，進(jìn)樣量在0.022～0.352 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。取對(duì)照品配置成不同濃度溶液，吸取10 μl，注入液相色譜儀中。見(jiàn)表1。

表1 線性范圍考察結(jié)果

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h，按正文含量測(cè)定方法測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，本品溶液于8 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.3.7 精密度實(shí)驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液按上述色譜條件操作，同法測(cè)定6次，結(jié)果表明，本方法精密度較高。見(jiàn)表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品6份，分別按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.3.9 回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品共6份，分別加入適量對(duì)照品，按供試品制備方法制備，測(cè)定含量，結(jié)果表明，本方法加樣回收率良好。見(jiàn)表5。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)

1.4 總蒽醌含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件同[游離蒽醌]含量測(cè)定項(xiàng)下。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備取[游離蒽醌]含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)照品溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備取1.2.2項(xiàng)下供試品溶液，精密量取5 ml，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.4.4 陰性液干擾實(shí)驗(yàn)取方中除大黃外的各藥材，按制備工藝制成樣品，再按“1.2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備成缺大黃陰性液。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性液各10 μl注入液相色譜儀，繪制液相色譜圖，結(jié)果在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性液在此峰位無(wú)吸收。見(jiàn)圖2。

1.4.5 線性范圍考察取對(duì)照品配置成不同濃度溶液，吸取10 μl，注入液相色譜儀中，結(jié)果見(jiàn)下表。

1.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h按正文含量測(cè)定方法測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，本品溶液于8 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表6。

表6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.4.7 精密度實(shí)驗(yàn)同1.3.7[游離蒽醌]含量測(cè)定項(xiàng)下。

1.4.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品6份，分別按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。見(jiàn)表7。

表7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.4.9 回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品共6份，分別加入適量對(duì)照品，按供試品制備方法制備，測(cè)定含量，結(jié)果表明，本方法加樣回收率良好。見(jiàn)表8。

1.5 樣品含量測(cè)定按游離蒽醌和總蒽醌含量測(cè)定方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定。見(jiàn)表9。

表9 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2 討論

本品由龍眼肉、花椒、艾葉、大黃組成，根據(jù)《中國(guó)藥典》[3]各項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定，龍眼肉、花椒沒(méi)有指標(biāo)性成分可以控制含量，艾葉中以桉油精為含量測(cè)定指標(biāo)，但是桉油精專屬性差，因此最終選用以大黃中的游離蒽醌和總蒽醌的含量作為測(cè)定指標(biāo)，用于控制本制劑質(zhì)量。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在現(xiàn)行色譜條件下得到了很好的分離。重復(fù)性好、精密度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，陰性液無(wú)干擾，在所用色譜條件下，理論塔板數(shù)≥3000，分離度≥1.5，拖尾因子在0.95～1.05，是較為成熟的含量測(cè)定方法。以此確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定可信度高，可以接納為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與結(jié)論

根據(jù)以上樣品測(cè)定結(jié)果及《中國(guó)藥典》[3]中大黃項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定，定為本品標(biāo)準(zhǔn)為含游離蒽醌以蘆薈大黃素(C15H10O5)、大黃酸(C15H8O6)、大黃素(C15H10O5)、大黃酚(C15H10O4)和大黃素甲醚(C16H12O5)的總量計(jì)，不得少于0.002%；含總蒽醌以蘆薈大黃素(C15H10O5)、大黃酸(C15H8O6)、大黃素(C15H10O5)、大黃酚(C15H10O4)和大黃素甲醚(C16H12O5)的總量計(jì)，不得少于0.015%。