鞠穎慧， 莫惠芳， 吳 蕙， 陳 樸， 郭 瑋， 王蓓麗

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞亞群分析、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤免疫分型診斷和免疫功能測定等。淋巴細(xì)胞亞群檢測項目包括T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）、輔助性T淋巴細(xì)胞（T helper cell，Th；CD3+CD4+）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL；CD3+CD8+）和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞（CD3-CD16+CD56+）。正常情況下，淋巴細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定，疾病造成免疫功能異常可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)目改變，故其百分比及數(shù)量的測定可用于評估患者的免疫狀態(tài)，作為診斷、治療相關(guān)血液病和免疫缺陷疾病的重要依據(jù)，還可用于評價腫瘤患者、器官移植患者免疫治療效果以及移植物的存活情況[1]。染色指數(shù)（staining index，SI）是衡量陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群分離程度的一個可靠指標(biāo)，與陽性細(xì)胞群的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）成正比，與陰性細(xì)胞群的MFI成反比，指數(shù)越大，分離效果越佳。目前，我國臨床實驗室使用的淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑多為進(jìn)口試劑，價格偏高，配貨周期長。為此，本研究擬對流式細(xì)胞術(shù)國產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑檢測淋巴細(xì)胞亞群的性能進(jìn)行比較，驗證2種試劑檢測結(jié)果的可比性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年4—6月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診患者96例、上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院就診患者50例、合肥市疾病預(yù)防控制中心固定監(jiān)測的獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者54例，共計200例，其中男115例、女85例，年齡19～86歲。

1.2 儀器與試劑

FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）及配套進(jìn)口6色TBNK試劑盒（簡稱進(jìn)口流式試劑，CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-PC7/CD19-APC/CD8-APCCy7），TruCount絕對計數(shù)管（美國BD公司），7色儀器設(shè)置微球（美國BD公司），CS&T熒光校準(zhǔn)微球（美國BD公司）。國產(chǎn)6色淋巴亞群檢測試劑盒（簡稱國產(chǎn)流式試劑，CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PEPC7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7，北京同生時代生物技術(shù)有限公司）及配套絕對計數(shù)微球管。IMMUNO-TROL細(xì)胞質(zhì)控品（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.3 方法

采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管（美國BD公司）采集所有對象靜脈血樣本，均于當(dāng)天檢測完畢。FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀采用CS&T熒光校準(zhǔn)微球和7色儀器設(shè)置微球校準(zhǔn)到最佳狀態(tài)，質(zhì)控在控后分別采用國產(chǎn)和進(jìn)口2種流式試劑檢測淋巴細(xì)胞亞群（CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞、CD3-CD16+CD56+細(xì)胞）。嚴(yán)格按儀器和試劑說明書操作。觀察指標(biāo)包括細(xì)胞百分比、細(xì)胞絕對數(shù)、每種細(xì)胞2種試劑在相同電壓條件下的陽性峰和陰性峰間距、每種細(xì)胞百分比（絕對數(shù)）的線性范圍等。在相同加樣量、最佳光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）電壓條件下，通過2種試劑的MFI和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（robust standard deviation，RSD）來對淋巴細(xì)胞亞群的SI進(jìn)行比較，計算公式為：SI=[MFI（陽性）-MFI（陰性）]/2×RSD（陰性）[2]。計算2種試劑之間的平均偏移，公式為：偏移（%）=（Yi-Xi）/Xi×100%，式中Yi為國產(chǎn)流式試劑結(jié)果，Xi為進(jìn)口流式試劑結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用配對t檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用符號秩和檢驗。采用Spearman相關(guān)分析評估各項目之間的相關(guān)性。一致性采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC）分析，ICC值的評價標(biāo)準(zhǔn)為：ICC＜0.4為可信度差，0.4～0.59為可信度中等，0.60～0.74為可信度良好，＞0.74為可信度優(yōu)[3]。參考《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[4]，將±5%作為允許誤差范圍，進(jìn)行偏移的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種流式試劑檢測結(jié)果比較

國產(chǎn)流式試劑的CD8+細(xì)胞和CD19+細(xì)胞百分比均低于進(jìn)口流式試劑（P＜0.05），CD3+細(xì)胞百分比高于進(jìn)口流式試劑（P＜0.05）。國產(chǎn)流式試劑CD3+細(xì)胞和CD19+細(xì)胞絕對數(shù)高于進(jìn)口流式試劑（P＜0.05）。2種流式試劑檢測CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞和CD3-CD16+CD56+細(xì)胞百分比的平均偏移分別為0.41%、-0.35%、2.11%、3.33%、-4.98%，絕對數(shù)的平均偏移分別為3.89%、0.98%、4.83%、4.13%、0.95%。見表1、表2。

表1 2種流式試劑淋巴細(xì)胞亞群百分比比較 %

表2 2種流式試劑淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)比較 個/μL

2.2 國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑的淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果的相關(guān)性良好（r＞0.9，P=0.000）。見表3、表4。

表3 國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑淋巴細(xì)胞亞群百分比檢測結(jié)果的相關(guān)性

表4 國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)檢測結(jié)果的相關(guān)性

2.3 國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑檢測結(jié)果一致性分析

國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞和CD3-CD16+CD56+細(xì)胞百分比檢測結(jié)果的ICC值[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]分別為0.983（0.978～0.987）、0.990（0.986～0.992）、0.989（0.986～0.992）、0.987（0.983～0.990）、0.991（0.989～0.993），絕對數(shù)的ICC值（95%CI）分別為0.955（0.940～0.965）、0.970（0.961～0.977）、0.958（0.944～0.968）、0.992（0.989～0.994）、0.967（0.957～0.975），ICC值均＞0.95（P＜0.001）。2種流式試劑有較好的一致性。

2.4 國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑SI分析

國產(chǎn)流式試劑對CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞的SI高于進(jìn)口流式試劑（P＜0.05），對CD4+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞、CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的SI低于進(jìn)口流式試劑（P＜0.05）。見圖1。

圖1 國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑SI比較

3 討論

淋巴細(xì)胞亞群檢測可對影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的多種因素的監(jiān)測提供重要信息[5]。CD4+淋巴細(xì)胞計數(shù)是監(jiān)測AIDS患者病情進(jìn)展和療效評價的重要指標(biāo)[6]。淋巴細(xì)胞亞群檢測也可用于急性白血病和淋巴瘤的初篩，能發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞及其表達(dá)的標(biāo)志物。惡性腫瘤患者也存在免疫異常，外周血T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞監(jiān)測可提供一定的參考依據(jù)。目前，流式細(xì)胞術(shù)是公認(rèn)的用于分析淋巴細(xì)胞亞群的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，然而，由于進(jìn)口流式試劑價格昂貴，且配貨周期長，因此如何選擇適合自己實驗室需求的國產(chǎn)流式試劑成為各臨床實驗室面臨的重要問題。為此，本研究對國產(chǎn)流式試劑的檢測性能進(jìn)行了驗證。

本研究收集了3家實驗室的200例樣本，確保淋巴細(xì)胞亞群覆蓋低、中、高3個水平。結(jié)果顯示，國產(chǎn)流式試劑的CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞百分比及CD3+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞絕對數(shù)檢測結(jié)果與進(jìn)口流式試劑比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但該差異僅能反映淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果均值或中位數(shù)的差異，無法反映數(shù)據(jù)的一致性。因此，還需通過分析檢測結(jié)果的一致性或可靠性來衡量這種差異造成的影響。ICC可用于評價不同測定方法或評定者對同一定量測量結(jié)果的一致性或可靠性，0表示不可信，1表示完全可信[8]，一般認(rèn)為ICC＞0.74為可信度好。本研究2種流式試劑之間的r值和ICC值均＞0.9，可確認(rèn)2種流式試劑檢測淋巴細(xì)胞亞群百分比和絕對數(shù)的一致性較好，結(jié)果具有可比性。在流式細(xì)胞分析中，陰、陽性抗原細(xì)胞的區(qū)分也十分重要，抗原陰性細(xì)胞或者碎片的背景熒光會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以應(yīng)選擇染色效果好的試劑。本研究結(jié)果顯示，雖然熒光抗體、細(xì)胞數(shù)量、染色時間、PMT相同，但是國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑SI的差異依然有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這可能是導(dǎo)致2種試劑檢測淋巴細(xì)胞亞群百分比和絕對數(shù)存在差異的原因之一。本研究CD4+細(xì)胞的檢測結(jié)果與嚴(yán)艷等[9]結(jié)果一致。

目前，用于淋巴細(xì)胞亞群檢測的樣本的處理和結(jié)果分析還是通過人工完成，未實現(xiàn)全自動化，因此淋巴細(xì)胞亞群檢測的影響因素較多。在相同的儀器和試劑條件下，儀器的狀態(tài)（電壓、熒光補(bǔ)償、閾值設(shè)定等）、樣本前處理（加樣量不準(zhǔn)、紅細(xì)胞裂解不完全等）、淋巴細(xì)胞散點圖分析方法等因素可能是淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果出現(xiàn)差異的主要原因。另外，試劑廠商熒光抗體的選擇也會對淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究使用的進(jìn)口流式試劑和國產(chǎn)流式試劑均采用相同的熒光染料，但克隆號、免疫球蛋白亞型、抗體種屬、發(fā)射峰等的不同可能也會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)差異。根據(jù)廠家試劑說明書，本研究使用的進(jìn)口流式試劑與國產(chǎn)流式試劑中CD3的克隆號分別為SK7、UCHT1，CD8的克隆號分別為SK1、HIT8a，其他項目的克隆號未能查證。此外，患者的種族和抗原決定部位表達(dá)的個體差異也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響[10]。由于目前我國流式細(xì)胞檢測結(jié)果的質(zhì)量控制尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[11]，因此本研究參考《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[4]進(jìn)行偏移的比較，結(jié)果顯示，2種試劑檢測淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果偏移均在可接受范圍內(nèi)。

綜上所述，國產(chǎn)流式試劑與進(jìn)口流式試劑檢測淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果雖有一定的差異，但相關(guān)性和一致性均較好。各臨床實驗室可根據(jù)自己的需求來選擇合適的抗體試劑。