何天文， 盧 建， 陳創(chuàng)奇， 劉 頓， 丁紅珂， 劉 玲， 杜 麗， 鄭毅春， 尹愛華

（1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院生殖中心，廣東 廣州 511442）

常染色體隱性遺傳性多囊腎?。╝utosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD）是一種罕見的常染色體隱性遺傳的單基因病，致病基因為多囊腎/多囊肝病變1（polycystic kidney and hepatic disease 1，PKHD1）基因[1]。ARPKD在臨床上比較罕見，發(fā)病率僅為1/40 000～1/20 000，以腎臟和肝臟為主要累及器官，臨床表型為雙側(cè)腎臟均勻?qū)ΨQ性增大，并常伴有肝脾腫大、肝硬化及膽管擴張等癥狀，多數(shù)患兒于圍產(chǎn)期或嬰幼兒時即發(fā)病死亡[2-3]。ARPKD發(fā)病早、預(yù)后極差，目前臨床尚無根治的辦法，主要通過植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）或產(chǎn)前診斷預(yù)防ARPKD患兒的出生。近年來，二代測序[又稱下一代測序（next generation sequencing，NGS）]技術(shù)飛速發(fā)展，測序成本不斷降低，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。NGS的準確性好、精度高，目前已經(jīng)成為胚胎PGT的主要方法之一，能檢測染色體非整倍性、染色體結(jié)構(gòu)異常和單基因遺傳病[4-5]。國內(nèi)外運用NGS技術(shù)對ARPKD家系進行PGT的報道較少，目前僅發(fā)布了《應(yīng)用胚胎植入前遺傳學檢測技術(shù)阻斷常染色體顯性多囊腎病遺傳的中國專家共識》[6]。為此，本研究對1個ARPKD家系進行PKHD1基因測序，在明確PKHD1基因致病突變的情況下，運用NGS技術(shù)對胚胎PKHD1基因突變位點進行直接測序，并構(gòu)建胚胎PKHD1基因突變位點連鎖單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點單倍型，為胚胎PTG和ARPKD產(chǎn)前診斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

先證者父親（Ⅰ1）：35歲，表型正常，既往體健。先證者母親（Ⅰ2）：33歲，表型正常，既往體健，G2P1A2，2012年8月剖宮產(chǎn)一足月女（先證者）；2016年12月孕8周胚胎停育，藥物流產(chǎn)，未對絨毛進行相關(guān)基因檢測。先證者（Ⅱ1）：女，5歲，因血尿、蛋白尿以及B超顯示腎臟有多發(fā)性囊狀改變、肝臟囊性病變進行遺傳性腎病相關(guān)基因檢測，外院檢測結(jié)果顯示PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G雙重雜合突變，見圖1。為了避免再次妊娠ARPKD患兒，該夫婦于2017年8月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心和生殖醫(yī)學中心就診咨詢要求行PGT。向該夫婦充分解釋PGT過程及相關(guān)風險后，該夫婦簽署知情同意書并接受PGT。本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院生殖醫(yī)學倫理委員會批準。

圖1 ARPKD家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及基因組DNA提取 采集先證者父母和先證者的靜脈血各2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用磁珠法血液基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取外周血基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作。PGT后，先證者母親于孕18～24周時在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水10 mL。采用Qiamp DNA Blood Mini Kit（德國Qigen公司）提取羊水基因組DNA，按照試劑盒說明書進行提取操作。

1.2.2 Sanger測序調(diào)查家系成員PKHD1基因突變情況 采用Oligo6軟件（美國Oligo公司）設(shè)計針對PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變位點的特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物。對擴增產(chǎn)物進行Sanger測序，測序儀器為ABI3730遺傳分析儀（美國ABI公司）。采用SeqMan軟件進行序列分析，觀察PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G的突變情況。

1.2.3 構(gòu)建父母雙方和先證者SNP單倍型 以PKHD1基因編碼區(qū)為目標區(qū)域，在該基因上下游2M區(qū)域內(nèi)選擇120個高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳連鎖標記，在Ion AmpliSeq Designer網(wǎng)站（https：//www.ampliseq.com）上設(shè)計多重PCR引物。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、建庫、NGS后，選擇有效SNP位點構(gòu)建先證者父母和先證者的SNP單倍型，連鎖分析后確定先證者父母攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風險染色體。

1.2.4 胚胎培養(yǎng)及胚胎活檢 常規(guī)促排卵取卵后，采用卵細胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）方式進行授精，受精后轉(zhuǎn)入分裂期胚胎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第3、5、6天觀察胚胎發(fā)育情況。胚胎發(fā)育第3天時用激光脈沖在透明帶上切割出1個直徑約20 μm的裂口，將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。胚胎發(fā)育第5天、第6天時觀察到囊胚形成且脫出裂口滋養(yǎng)層細胞數(shù)為2～9個時進行活檢。用活檢針吸取脫出裂口的滋養(yǎng)層細胞，在磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）液滴中清洗后轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管中。對活檢的囊胚編號后進行玻璃化冷凍處理，待遺傳學檢測完成后再行解凍移植。

1.2.5 胚胎PGT 對活檢獲得的滋養(yǎng)層細胞進行基于等溫多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）技術(shù)的全基因組擴增。全基因組擴增產(chǎn)物通過多重PCR擴增PKHD1基因編碼區(qū)和高密度緊密連鎖的SNP。多重PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化和建庫后進行NGS。采用NGS對胚胎PKHD1基因突變位點進行直接測序，構(gòu)建PKHD1基因突變連鎖SNP單倍型并進行連鎖分析。采用Sanger測序驗證胚胎PKHD1基因突變位點的NGS結(jié)果。針對正常和雜合攜帶的胚胎進行低深度的染色體非整倍性篩查，以排除攜帶染色體拷貝數(shù)異常的胚胎。

1.2.6 胚胎移植和產(chǎn)前診斷 選擇未檢測到突變且發(fā)育良好的整倍體胚胎于凍融胚胎周期進行移植。胚胎移植14 d后查血人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）確定是否妊娠；胚胎移植4周后行經(jīng)陰道B超確定是否臨床妊娠。孕18～24周時行羊膜腔穿刺，進行染色體核型分型和PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變產(chǎn)前診斷，以驗證PGT結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ARPKD家系成員攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G.突變情況

Sanger測序結(jié)果顯示，ARPKD家系成員中，父親攜帶PKHD1基因c.5935G＞A，為雜合子；母親攜帶PKHD1基因c.10058T＞G，為雜合子；先證者攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G雙重雜合突變，分別遺傳自父親和母親。見圖2。

圖2 先證者及其父母PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變Sanger測序圖

2.2 先證者父母和先證者的SNP單倍型

以PKHD1基因編碼區(qū)為目標區(qū)域，在上下游2M區(qū)域內(nèi)選擇120個高密度緊密連鎖的SNP位點作為遺傳連鎖標記。經(jīng)過多重PCR和NGS檢測后，選擇69個有效SNP位點構(gòu)建先證者父母和先證者的SNP單倍型，確定先證者父母攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風險染色體。見表1。

表1 先證者父母有效SNP位點數(shù)和分布

2.3 植入前遺傳學診斷

培養(yǎng)第5天觀察到5個胚胎達到活檢標準，即對囊胚進行活檢和胚胎玻璃化冷凍保存，將活檢產(chǎn)物標記為D501、D502、D503、D504和D505，每個樣本活檢細胞數(shù)為2～9個。采用NGS對胚胎PKHD1基因突變位點進行直接測序、胚胎單倍型連鎖分析，同時采用Sanger測序進行驗證。結(jié)果顯示，5個胚胎中，D501和D502未檢測到突變，D503和D505攜帶PKHD1基因c.5935G＞A突變（雜合子），D504攜帶PKHD1基因c.10058T＞G突變（雜合子）。見表2、圖3。

圖3 胚胎單倍型連鎖分析結(jié)果

表2 5個胚胎PKHD1基因c.472C＞T突變NGS和Sanger測序結(jié)果

對5個胚胎進行低深度染色體非整倍體篩查，結(jié)果顯示，D501、D503和D505為整倍體胚胎，D502和D504為非整倍體胚胎。見表3。

表3 胚胎PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變PGT結(jié)果

2.4 等位基因脫扣率（allele drop-out，ADO）分析

5個活檢胚胎的PKHD1基因致病突變位點c.5935G＞A（chr6：51799094）和c.10058T＞G（chr6：51609281）未發(fā)生脫扣。根據(jù)5個活檢胚胎的2個致病突變位點和69個SNP位點的脫扣等位基因數(shù)得出復(fù)合ADO率為0.81%。

2.5 胚胎移植及產(chǎn)前診斷

囊泡活檢后，在第3個月經(jīng)周期行囊胚解凍移植。參考PGT結(jié)果選擇遺傳學檢測結(jié)果為未檢測到突變且發(fā)育良好的整倍體胚胎（D501）進行移植。移植14 d后檢測外周血hCG為陽性，移植50 d后經(jīng)陰道超聲檢查見單個孕囊，大小為34 mm×22 mm，胚芽長9 mm，可見心管搏動。孕18周經(jīng)羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示，胎兒染色體核型分型無異常，未檢測到PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變（圖4），與PGT結(jié)果一致。孕38周順產(chǎn)一正常嬰兒，健康狀況良好。

圖4 胎兒PKHD1基因c.5935和c.10058位點的Sanger測序

3 討論

ARPKD是一種罕見的常染色體隱性遺傳的單基因病，致病基因為PKHD1基因。PKHD1基因是目前所知人類ARPKD的唯一致病基因，定位于人類染色體6p21，約為472 kb，包含67個外顯子，編碼1個由4 074個氨基酸組成的單次跨膜受體樣蛋白——纖維素蛋白[7-8]。PKHD1基因以編碼區(qū)的點突變致病為主，非編碼區(qū)突變、大片段缺失、重復(fù)或重排只是致病原因的極少數(shù)。目前，基因變異數(shù)據(jù)庫（http：//www.humgen.rwth-aachen.de）中報道的PKHD1突變種類已達748種，其中約60%為錯義突變，40%為截短突變（無義突變、剪切突變和移碼突變）[9]，其中c.107C＞T（p.Thr36Met）和c.9689delA（p.Asp3230ValfsX9）是相對常見的突變，約占20%[10-11]。PKHD1基因發(fā)生突變會導(dǎo)致該蛋白結(jié)構(gòu)或功能異常，從而影響腎臟集合系統(tǒng)及肝臟膽管系統(tǒng)發(fā)育及成熟。ARPKD以腎臟和肝臟為主要受累器官，臨床表型為雙側(cè)腎臟均勻?qū)ΨQ性增大，并常伴有肝脾腫大、肝硬化及膽管擴張等癥狀，多數(shù)患兒于圍產(chǎn)期或嬰幼兒時即發(fā)病死亡。ARPKD與大多數(shù)單基因疾病一樣，尚無有效的根治方法。攜帶PKHD1基因突變的夫婦每次生育下一代都有25%的概率患ARPKD，通過產(chǎn)前診斷雖然可以防止ARPKD患兒的出生，但是絨毛活檢、羊水穿刺、臍帶血穿刺等傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)具有創(chuàng)傷性，孕婦有一定的流產(chǎn)風險。如果通過傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷確診胎兒為ARPKD，則攜帶PKHD1突變基因的夫婦就需要選擇終止妊娠。因此，在胚胎植入前進行遺傳學檢測，并選擇正常胚胎進行移植，可以避免妊娠ARPKD胚胎，從而阻斷PKHD1基因突變在家系中的傳遞。同時還可以對胚胎進行低深度的染色體非整倍體篩查，以排除攜帶染色體拷貝數(shù)異常的胚胎，避免選擇非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)。因此，PGT與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷相比具有明顯的優(yōu)勢[11-12]。

由于每個胚胎活檢所得細胞數(shù)很少，提取的DNA量達不到分子檢測所需的水平，需要通過全基因組擴增的方法來擴增基因組DNA?；贛DA技術(shù)的全基因組擴增技術(shù)[13]不但克服了單細胞水平分子檢測DNA模板量過少的問題，也極大地提高了檢測結(jié)果的準確性和單細胞水平基因檢測的可靠性，但全基因組擴增技術(shù)會增加檢測結(jié)果擴增不均勻或等位基因脫扣的風險[14]。NGS將單堿基測序成本降至了最低，也給PGT帶來了革命性的改變[15]。有學者應(yīng)用基于微衛(wèi)星連鎖分析的方法進行多囊腎病的PGT[16]，相比之下，通過NGS完成植入前檢測的時間周期更短、更高效。與傳統(tǒng)的PGT技術(shù)，如熒光原位雜交和比較基因組雜交等相比，NGS具有明顯優(yōu)勢，目前已逐漸成為PGT的主要檢測方法[17]。本研究以PKHD1基因編碼區(qū)為目標區(qū)域，在上下游2M區(qū)域內(nèi)選擇120個高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳連鎖標記，選擇了69個有效SNP位點構(gòu)建先證者父母的單倍型，確定其攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風險染色體，減少了基因重組或全基因組擴增脫扣導(dǎo)致的檢測結(jié)果錯誤。本研究統(tǒng)計了5個活檢胚胎的2個致病突變位點和69個SNP位點的脫扣等位基因數(shù)，得出復(fù)合ADO率為0.81%。

綜上所述，本研究成功應(yīng)用NGS技術(shù)對ARPKD家系進行PGT，阻斷了該單基因病在該家系中的再次發(fā)生，避免了選擇非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)問題，是ARPKD出生缺陷的有效預(yù)防方法。