褚敏君， 李小娟， 黃海林， 李 玨， 麻明彪， 杜廷義， 王海平

（昆明市兒童醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650228）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是一種病死率極高的全身感染性疾病[1]，快速、準(zhǔn)確地檢出血液中的病原菌，可有效降低病死率，提高治愈率。在臨床工作中，因各種原因常常不能及時將血培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)系統(tǒng)中，延遲放瓶現(xiàn)象較為普遍。針對延遲放瓶對血培養(yǎng)陽性檢出情況的影響，本研究選取肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）這2種兒童感染常見的苛養(yǎng)菌，制備不同濃度含菌血液模擬樣本，比較其室溫放置不同時間后，在2種自動化血培養(yǎng)系統(tǒng)中的陽性檢出情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌（ATCC 49619）和流感嗜血桿菌（ATCC 9007）購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑

BACTEC FX血培養(yǎng)儀及配套中和兒童抗菌藥物需氧瓶BactecPeds Plus（美國BD公司）。BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀及配套兒童中和抗菌藥物需氧瓶 BacT/ALERT PF（法國生物梅里埃公司）。無菌血液來自身體健康未使用過抗菌藥物的獻(xiàn)血者。

1.3 方法

用無菌0.9% NaCl溶液將標(biāo)準(zhǔn)菌株配制成1×102、1×103和1×105CFU/mL的菌懸液備用，通過菌落計數(shù)確證菌懸液濃度。在每個血培養(yǎng)瓶中均注入5 mL無菌全血，再加入1 mL配制的菌懸液混勻，每份樣本重復(fù)配制3瓶。將含不同濃度菌懸液的血培養(yǎng)瓶分別在室溫（22 ℃）中放置0、8、16和24 h后，分別放入BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀和BACTEC FX血培養(yǎng)儀中。培養(yǎng)儀的預(yù)設(shè)培養(yǎng)時間為5 d，若5 d后系統(tǒng)仍未報陽，則為培養(yǎng)陰性。報陽樣本報陽時間為3瓶的平均值。抽取所有培養(yǎng)瓶內(nèi)液體，轉(zhuǎn)種后進(jìn)行菌種鑒定，以確認(rèn)生長菌為接種菌，且未被污染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用重復(fù)測量方差分析評價受試者內(nèi)因素（不同的血培養(yǎng)系統(tǒng)、延遲放瓶時間和菌液濃度）對因變量（細(xì)菌報陽時間）的影響。采用Mauchly球?qū)ΨQ假設(shè)檢驗分析受試者內(nèi)因素的交互作用；對不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)的數(shù)據(jù)，采用Greenhouse-Geisser計算球?qū)ΨQ系數(shù)ε，校正結(jié)果。呈正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，2組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

不同濃度肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌接種瓶經(jīng)室溫放置不同時間后，在2種血培養(yǎng)儀中均自動檢出陽性。報陽時間見表1。

表1 不同延遲放瓶時間2種苛養(yǎng)菌不同血培養(yǎng)儀平均報陽時間 h

2.2 不同因素及其交互效應(yīng)對報陽時間的影響

BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)報陽時間短于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)，報陽時間隨延遲放瓶時間的增加呈延長趨勢，隨菌液濃度的增高呈縮短趨勢（P＜0.001）。肺炎鏈球菌延遲放瓶0 h的報陽時間與8、16、24 h比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；流感嗜血桿菌延遲放瓶0 h的報陽時間與8、24 h比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同因素及其交互效應(yīng)對苛養(yǎng)菌報陽時間的影響

3 討論

作為診斷BSI的金標(biāo)準(zhǔn)，血培養(yǎng)在臨床工作中發(fā)揮著重要作用。提高血培養(yǎng)陽性檢出率、縮短檢測時間，一直是臨床微生物實驗室努力的目標(biāo)。血培養(yǎng)陽性結(jié)果的正確與否受樣本、儀器、檢測原理等多種因素的影響[2]。BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)和BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)是目前臨床微生物實驗室廣泛使用的血培養(yǎng)系統(tǒng)，但2個血培養(yǎng)系統(tǒng)對常見病原菌的陽性檢出率和報陽時間存在一定的差異[3]。

在實際工作中，由于工作流程和資源投入等多種因素的制約，血培養(yǎng)樣本采集后不能及時放入培養(yǎng)儀的情況較為普遍，分析延遲放瓶對血培養(yǎng)陽性檢測結(jié)果的影響十分重要。孫景勇等[4]發(fā)現(xiàn)，延遲放瓶＜16 h，BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)和BACTEC 9120血培養(yǎng)系統(tǒng)的陽性檢出率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而延遲放瓶24 h，前者的陽性檢出率明顯高于后者（P＜0.05）。本研究中，所有樣本經(jīng)室溫放置不同時間后，在2種血培養(yǎng)系統(tǒng)中均可檢測到陽性結(jié)果。產(chǎn)生差異的原因可能與測試菌種不同有關(guān)，孫景勇等[4]測試的是大腸埃希菌，其在放置過程中可能會因為產(chǎn)酸量積累的原因，干擾血培養(yǎng)儀的監(jiān)測過程和結(jié)果判斷。此外，本研究使用的BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)與BACTEC 9120血培養(yǎng)系統(tǒng)在檢測原理上的差別也可能是陽性檢出率出現(xiàn)差異的原因。

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌作為臨床常見苛養(yǎng)菌，是我國兒童臨床分離優(yōu)勢株，分離率明顯高于成人[5]，在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院BSI病原中所占比例呈逐年上升趨勢[6]。本研究中，2種苛養(yǎng)菌在BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)中的報陽時間均短于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)（P＜0.001），與相關(guān)報道結(jié)果[7-8]一致。肺炎鏈球菌經(jīng)室溫延遲放置8、16和24 h后，報陽時間均顯著長于0 h放置樣本。有研究結(jié)果表明，肺炎鏈球菌可在血培養(yǎng)陽性報警后8～10 h內(nèi)自溶死亡[9]，延遲培養(yǎng)樣本報陽時間延長可能也與此相關(guān)，因此臨床懷疑肺炎鏈球菌BSI時，應(yīng)立即送檢。而流感嗜血桿菌經(jīng)室溫延遲放置0和8 h，報陽時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），室溫放置8 h不影響其在2種血培養(yǎng)系統(tǒng)中的報陽時間，提示延遲放瓶對不同菌種的陽性檢出影響不同。

本研究還發(fā)現(xiàn)，菌液濃度、延遲放瓶、血培養(yǎng)系統(tǒng)3個因素之間有相互作用，共同影響血培養(yǎng)檢測結(jié)果。肺炎鏈球菌延遲放瓶時，報陽時間受另外2個因素的共同影響 ，BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測低濃度肺炎鏈球菌樣本時，報陽時間受延遲放瓶影響，而高濃度樣本的報陽時間受延遲放瓶的影響不明顯。流感嗜血桿菌血培養(yǎng)系統(tǒng)和菌液濃度會相互影響，在低濃度條件下，BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)報陽時間短于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)，而高濃度條件下，差異不明顯。

綜上所述，隨著延遲放瓶時間的延長，2種苛養(yǎng)菌報陽時間均呈延長趨勢，BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)在報陽時間上相較于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)具有一定優(yōu)勢。這一趨勢受多因素作用，不同菌種、菌液濃度及血培養(yǎng)系統(tǒng)均會影響延遲送檢時細(xì)菌的陽性檢出情況。本研究僅對兒童瓶及2種常見苛養(yǎng)菌進(jìn)行了初步評估，具有一定的局限性。各臨床微生物室應(yīng)根據(jù)自身實際情況，有針對性地進(jìn)行血培養(yǎng)影響因素的評估和控制，建議評估并逐步完善對陰性培養(yǎng)瓶的盲轉(zhuǎn)培養(yǎng)，以最大限度避免因受延遲放瓶影響而造成的漏檢。