石金雙 劉金艷 肖樹林 張江琳 李晨

750001，銀川市口腔醫(yī)院 1.牙周黏膜科，2.正畸科

人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLCs）與牙周組織的再生、修復(fù)、重建關(guān)系密切，具有成骨分化特性，可用于牙周疾病治療［1］。維生素D與牙周健康關(guān)系密切，而骨化三醇（VD3）是活性最強(qiáng)的維生素D形式，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞增殖［2］，但具體機(jī)制尚不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B（NF-κB）的活化在破骨細(xì)胞性骨溶解的病理過程中起承上啟下的作用，可誘導(dǎo)炎癥因子分泌并致骨溶解，抑制 NF-κB的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、促分化［3］，猜測(cè) VD3可能通過調(diào)控 NF-κB影響 hPDLCs。本研究從牙周膜組織中分離hPDLCs，VD3干預(yù)后行NF-κB激活或抑制處理，探討VD3影響hPDLCs的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

VD3（CAS：19356-17-3，10 mg）、NF-κB通路抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamates，PDTC）（P8765，Sigma，美國）；NF-κB通路特異性激活劑腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factorα，TNF-α）（Fitzgerald-10R-1382，Ambion公司，美國）；堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒（TE0009，上海星科生物科技有限公司）；一抗角蛋白（Cytokeratin）、波形絲蛋白（Vimentin）、NF-κB p65、Lamin B1、二抗山羊抗兔（Abcam公司，英國）。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime quantitative PCR，qRT-PCR）儀（ABI公司，美國）；GelDoc XR＋蛋白凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 hPDLFs取材

取銀川市口腔醫(yī)院牙科青少年正畸拔除的前磨牙，刮取根部1／3處牙周膜組織。

1.3 hPDLFs鑒定

常規(guī)培養(yǎng)牙周膜組織，提取原代細(xì)胞，細(xì)胞爬片，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白、波形絲蛋白表達(dá)。

1.4 VD3濃度確定

實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組、對(duì)照＋2%DMSO組、VD3濃度（mol／L）分別為 10－14、10－12、10－10、10－8。第 0、1、3、5、7 d添加CCK-8試劑酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔細(xì)胞吸光度A值。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、對(duì)照＋DMSO組、VD3組（10－8VD3）、VD3＋NF-κB抑制劑組（10－8VD3＋10μmol／L PDTC）、VD3＋NF-κB激活劑組（10－8VD3＋20 ng／mL TNF-α）。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

1.4 處理各組細(xì)胞5 d酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔細(xì)胞A值。

1.7 ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性

收集細(xì)胞按照ALP檢測(cè)試劑盒說明書，波長560 nm處檢測(cè)吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP活性。

1.8 茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞礦化情況

細(xì)胞礦化誘導(dǎo)10 d，1%茜素紅染色30 min，光學(xué)顯微鏡下拍照，Image Pro Plus6.0軟件鑒定礦化結(jié)節(jié)A水平。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（RUNX2）、骨鈣素（OCN）mRNA水平

細(xì)胞處理10 d，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-qPCR儀對(duì) ALP、RUNX2、OCN、內(nèi)參 GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下，ALP上游引物（Forward primer，F(xiàn)）：5′-ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG-3′、下游引物（Reverse primer，R）：5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′；RUNX2 F：5′-TCTGGCCTTCCACTCTCAGT-3′；R：5′-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3′；OCN F：5′-ATGAGAGCCCTCACACTCCTCG-3′、R：5′-GTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3′，GAPDH F：5′-GCACCGTCA AGGCTGAGAAC-3′、R：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAG T-3′，8μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

1.10 Western blot檢測(cè)細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)

核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、PVDF轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入一抗NF-κB p65、內(nèi)參Lamin B1，4℃孵育過夜；加入二抗山羊抗兔室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照，定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLFs的鑒定

hPDLFs呈長梭形，透明度高，折射率強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)大小均勻。細(xì)胞角蛋白染色陰性、波形絲蛋白胞質(zhì)區(qū)染色陽性（圖1）。

圖1 hPDLFs鑒定 （免疫熒光，×200）

2.2 不同濃度VD3處理檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

隨著VD3濃度的升高、實(shí)驗(yàn)天數(shù)的變長，細(xì)胞A450降低，具體情況見表 1。10－8VD3差異最明顯，因此10－8VD3做進(jìn)一步研究。

表1 不同濃度VD3（mol／L）處理后各組細(xì)胞A450值比較（n＝6，±s）

表1 不同濃度VD3（mol／L）處理后各組細(xì)胞A450值比較（n＝6，±s）

組 別 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d對(duì)照組 0.19±0.02 0.27±0.03 0.47±0.05 0.69±0.07 0.54±0.06對(duì)照＋DMSO組 0.18±0.02 0.28±0.03 0.48±0.06 0.70±0.08 0.55±0.05 10－14 VD3組 0.20±0.03 0.26±0.04 0.46±0.05 0.61±0.06 0.51±0.04 10－12 VD3組 0.19±0.02 0.29±0.03 0.43±0.04 0.54±0.05 0.47±0.05 10－10 VD3組 0.20±0.02 0.26±0.02 0.36±0.04 0.46±0.04 0.43±0.04 10－8 VD3組 0.17±0.02 0.21±0.02 0.31±0.05 0.38±0.04 0.36±0.04 F值 1.697 5.482 11.824 28.567 14.149 P值 0.166 0.001 0.000 0.000 0.000

2.3 5組細(xì)胞增殖情況

在VD3基礎(chǔ)上添加NF-κB抑制劑細(xì)胞A450水平降低，添加NF-κB激活劑細(xì)胞A450水平升高（表2）。

2.4 5組細(xì)胞ALP活性情況

在VD3基礎(chǔ)上添加NF-κB抑制劑細(xì)胞ALP活性升高，添加NF-κB激活劑細(xì)胞ALP活性降低（表2）。

表2 5組細(xì)胞培養(yǎng)5 d時(shí)CCK-8實(shí)驗(yàn)的A值、ALP含量、茜素紅染色A值比較（n＝6，±s）

表2 5組細(xì)胞培養(yǎng)5 d時(shí)CCK-8實(shí)驗(yàn)的A值、ALP含量、茜素紅染色A值比較（n＝6，±s）

注：①與對(duì)照組相比，P＜0.05；②與對(duì)照＋DMSO組相比，P＜0.05；③與VD3組相比，P＜0.05；④與VD3＋NF-κB抑制劑組相比，P＜0.05

組 別 CCK-8實(shí)驗(yàn)A450 ALP含量（U／g prog） 茜素紅染色A450對(duì)照組 0.64±0.07 6.84±0.73 0.03±0.01對(duì)照＋DMSO組 0.65±0.06 6.89±0.81 0.03±0.01 VD3組 0.35±0.04①② 15.67±1.21①② 0.36±0.04①②VD3＋NF-κB抑制劑組 0.19±0.03①②③ 23.43±2.18①②③ 0.47±0.05①②③VD3＋NF-κB激活劑組 0.47±0.04①②③④ 10.64±1.17①②③④ 0.21±0.03①②③④F值 91.429 167.783 222.692 P值 0.000 0.000 0.000

2.5 5組細(xì)胞礦化情況

在VD3基礎(chǔ)上添加NF-κB抑制劑細(xì)胞礦化增強(qiáng)，添加VD3＋NF-κB激活劑細(xì)胞礦化減輕（圖 2）。

圖2 5組細(xì)胞礦化檢測(cè) （茜素紅染色，×200）

2.6 5組細(xì)胞中 ALP、RUNX2、OCN mRNA、細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白水平

在VD3基礎(chǔ)上添加NF-κB抑制劑細(xì)胞中ALP、RUNX2、OCN mRNA水平升高，細(xì)胞核中 NF-κB p65蛋白水平降低；添加 NF-κB激活劑組細(xì)胞中 ALP、RUNX2、OCN mRNA水平降低，細(xì)胞核中 NF-κB p65蛋白水平升高（圖3、表3）。

表3 5組細(xì)胞中ALP、RUNX2、OCN mRNA和細(xì)胞核中NF-κB、p65蛋白水平比較 （n＝6）

圖3 5組細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)

3 討 論

牙周炎會(huì)造成牙槽骨吸收，附著喪失、影響咀嚼功能［4］，牙周膜細(xì)胞在一定條件下能向成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，為牙周組織再生提供了可能。VD3作為維生素D的活性代謝產(chǎn)物，可促進(jìn)成骨細(xì)胞合成，對(duì)細(xì)胞成骨形成具有直接作用［5］。本研究提取hPDLCs，探究VD3對(duì)細(xì)胞分化影響，VD3能夠促進(jìn)ALP活性和RUNX2、OCN mRNA水平表達(dá)，ALP可釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，參與細(xì)胞外基質(zhì)礦化過程，是hPDLCs分化的重要指標(biāo)［6］；RUNX2可促進(jìn)成骨前體細(xì)胞、骨原細(xì)胞分化并促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟［7］；OCN與骨基質(zhì)內(nèi)烴磷灰石緊密連接，是成骨細(xì)胞和骨礦化的特殊標(biāo)志物［8］。VD3可抑制細(xì)胞增殖，且促進(jìn)成骨前體細(xì)胞、骨原細(xì)胞分化、促進(jìn)骨非膠原蛋白的形成、促進(jìn)細(xì)胞礦化，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。在牙齦卟啉單胞菌感染的PDLCs中病原菌可刺激NF-κB的抑制分子IκB磷酸化，促進(jìn)NF-κB入核，調(diào)控靶基因后激活炎癥反應(yīng)、抑制成骨分化［9］；在細(xì)胞增殖中，貝沙羅汀在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的處理可以通過抑制NF-κB從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡、DNA損傷，抑制活性氧生成和總抗氧化劑水平，抑制細(xì)胞增殖［10］。本研究中在VD3的基礎(chǔ)上添加NF-κB抑制劑后，hPDLCs中細(xì)胞增殖減弱、成骨分化因子ALP活性和mRNA，RUNX2、OCN mRNA水平進(jìn)一步升高，礦化增強(qiáng)；提示VD3能夠抑制NF-κB通路從而抑制hPDLCs增殖、促進(jìn)成骨分化。

VD3可通過抑制NF-κB入核進(jìn)而抑制hPDLCs細(xì)胞增殖、促進(jìn)成骨分化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)牙周疾病的緩解作用。但VD3影響NF-κB入核的具體機(jī)制尚不清楚，是本文接下來研究重點(diǎn)。