于成龍 薛博元 楊勇 唐學敏 李建衛(wèi) 劉郭琦 宋嬌嬌 左金華

前期研究已發(fā)現(xiàn)，導管結(jié)扎后再通，萎縮的腺體可再生并恢復形態(tài)與功能，但其再生的信號機制尚未明了［1］。細胞基底膜上的層粘連蛋白（laminin，LAM）可與其受體整合素 α6β1（integrinα6β1，ITGα6β1）相互作用，并通過胞內(nèi)的信號傳導中樞黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）將細胞外機械力信號傳遞到細胞內(nèi)，進而調(diào)控細胞的遷移、粘附、凋亡等多種生物學行為［2－3］。本實驗擬通過檢測 LAM、ITGα6β1、FAK分子在大鼠萎縮腮腺再生過程中表達變化，初步探討腮腺損傷后再生的內(nèi)在機制，為治療唾液腺萎縮性疾病的相關(guān)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LAMγ1、ITGα6、ITGβ1兔抗大鼠單抗（Abcam公司，英國）；FAK兔抗大鼠多抗（CST公司，美國）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德）；5X蛋白上樣緩沖液（大連美侖）；SDS-PAGE凝膠配置劑（上海碧云天）；PCR試劑盒（湖南艾科瑞）。

1.2 動物實驗

60只8周齡雌性Wistar大鼠隨機分為實驗組（54只）和對照組（6只）。實驗組隨機分為結(jié)扎組（A組）和再通組（B組）。結(jié)扎組對大鼠腮腺主導管進行結(jié)扎，結(jié)扎7 d后獲取腮腺組織標記為A7組（n＝6）；再通組于導管結(jié)扎7 d后全部再通，根據(jù)再通后的觀察時間不同（再通第1、3、5、7、10、14、21、28天）隨機分為為 B1、B3、B5、B7、B10、B14、B21、B28組 8個亞組（n＝6）。對照組標記為N組。

1.3 切片制備與HE染色

固定后的組織進行脫水、透明、包埋、切片。依次置于二甲苯、梯度酒精中脫蠟至水。按照HE染色試劑盒要求進行操作，晾干，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學改變。

1.4 免疫組織化學染色

切片以SABC法進行免疫組織化學染色（高壓蒸汽法進行抗原熱修復），嚴格控制顯色反應(yīng)時間。封片，同等光源條件鏡下拍照，Image-Pro Plus6圖像分析軟件對每張圖片進行平均光密度值分析。PBS替代一抗為空白對照。

1.5 Western blot檢測

按蛋白試劑盒說明提取各樣本的蛋白質(zhì)，采用BCA法進行蛋白濃度測定。根據(jù)濃度配制等質(zhì)量體系，煮樣。40μg蛋白樣品上樣于預先配制好的PAGE凝膠上電泳（恒壓80 V 50 min，恒壓 100 V 50 min），電泳結(jié)束后，恒流250 mA條件下在冰上轉(zhuǎn)膜2 h，牛奶搖床封閉5 h，一抗4℃過夜，二抗室溫下?lián)u床1 h，ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）進行曝光，拍照，Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 實時熒光定量PCR

提取總RNA，測定RNA純度及濃度（以A260／A280比值在1.8～2.0為可用）。按照Evo M-MLV試劑盒說明合成cDNA。在冰上配制25μL qPCR反 應(yīng) 體系，每個樣本作3個復孔。在熒光定量PCR儀（Bio-Rad，CFX96TM，美國）上機并設(shè)置反應(yīng)條件：95℃30 s 1 cycle；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。讀取并保存結(jié)果，計算 2－△△Ct值。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行處理，實驗組、對照組之間差異的比較采用兩獨立樣本t檢驗，實驗組中不同時間位點取材的組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

正常腮腺組織腺小葉內(nèi)可見腮腺腺泡細胞數(shù)量豐富，排列嚴密。結(jié)扎組腮腺腺泡細胞喪失，炎癥細胞浸潤，腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂。再通后腺泡細胞數(shù)量逐漸增多，腺泡之間間隙減小，導管周圍炎癥細胞減少。至B28組整個腺小葉組織形態(tài)與正常組無明顯差異（圖1）。

圖1 大鼠腮腺萎縮、再生過程HE染色 （×400）Fig 1 HE staining of parotid gland during atrophy and regeneration in rats （×400）

2.2 免疫組化結(jié)果

LAM在正常腺體組織中強表達，定位于腺泡細胞的基底膜，線性圍繞細胞表面（圖 2A）。結(jié)扎后腺泡基底膜破壞，A7組可見LAM染色中斷明顯，折疊褶皺、形狀不規(guī)則（圖2B），再通后LAM在腺泡細胞周圍的連續(xù)性逐漸恢復，基底膜逐漸完整（圖2C～2E）。染色強度在結(jié)扎第7天增強，再通后減弱，至B5組到最低值后逐漸增強，于B14組達到峰值隨后降低（P＜0.05）。

ITGα6、β1共定位于腺泡細胞、導管上皮細胞的細胞膜中，染色規(guī)則完整（圖2F，2K）。導管結(jié)扎后整合素α6、β1在腺泡細胞基底部的染色逐漸中斷，寬窄不一（圖2G，2L），再通后連續(xù)性逐漸恢復，至再通B28組，染色模式均與正常腮腺相似（圖2J，2O）。染色強度在再通后減弱，于第3天到達拐點后上升，隨后整合素α6在再通第14天到達峰值后下降，β1以B10組表達量最高而后下調(diào)（P＜0.05），至B28組表達量與正常組無統(tǒng)計學意義。

FAK則強烈且彌漫性表達在腺泡細胞的胞質(zhì)中，導管系統(tǒng)表達不明顯。在結(jié)扎7 d后FAK表達強度有所降低，再通后逐漸增高（P＜0.05），至 B28組，F(xiàn)AK在腮腺組織染色與正常組無明顯差異（圖2P～2T）。

圖2 腮腺組織免疫組織化學染色（×400）Fig 2 Immunohistochemistry of the parotid gland tissue （×400）

2.3 Western blot檢測與實時熒光定量PCR結(jié)果

LAM、ITGα6、ITGβ1在該模型中的蛋白變化趨勢與基因水平變化趨勢基本一致，在導管結(jié)扎7 d組（A7），LAM、ITGα6、ITGβ1表達量較正常組有所升高，再通后出現(xiàn)減低趨勢。LAM在再通后第5天（B5）達到最低值后升高，至B14組到達峰值后下調(diào)。整合素α6、β1在再通第3天（B3）達到最低值后上升，隨后ITGα6以B14組到達峰值，ITGβ1以B10組達到最高值，又均逐漸下調(diào)，至B28組與正常組無顯著差異。FAK在結(jié)扎后7天時表達量下調(diào)，再通后逐漸增高至28組比正常組無統(tǒng)計學意義（圖3～4）。

圖 4 LAM／ITGα6β1／FAK相關(guān)分子 mRNA表達變化Fig 4 The mRNA levels of LAM／ITGα6β1／FAK relative factors

3 討 論

導管結(jié)扎后再通導管以及腺體內(nèi)壓力變化，最終引起了萎縮性腮腺組織再生。多項研究表明，層粘連蛋白、整合素、FAK均可參與傳遞機械力信號，使細胞對其微環(huán)境作出感知和反應(yīng)，從而自適應(yīng)地重塑組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能。Di Russo等［4］認為血管內(nèi)皮細胞基底膜上的層粘連蛋白是血管能夠?qū)芮粌?nèi)力學改變作出反應(yīng)的基礎(chǔ)。Ma等［5］發(fā)現(xiàn)整合素 FAK-ERK／PI3K介導了機械刺激對原代髁突軟骨細胞增殖活性和凋亡的重要作用。牽引力下會使間充質(zhì)干細胞（MSCs）整合素受體的數(shù)量增加，并表現(xiàn)出更明顯的分化傾向［6］，這種分化傾向是組織再生的基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在正常組織以及萎縮腮腺再通過程中，LAM與ITGα6β1始終共定位于腺泡細胞基底膜。在導管結(jié)扎后再通過程中，層粘連蛋白、整合素α6β1表達量變化趨勢幾乎同步。LAM與ITGα6β1在腺泡細胞表達的空間相關(guān)性以及表達量變化的同步性均表明，在導管結(jié)扎、釋放過程中，跨膜蛋白整合素α6β1始終受基底膜上的配體層粘連蛋白調(diào)控，并起到信號傳遞的作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，導管結(jié)扎7 d即可引起腮腺嚴重萎縮，再通后腮腺組織再生；而結(jié)扎28 d后再通，腮腺很難再生［7］，因此本實驗選擇導管結(jié)扎至7 d后再通。導管結(jié)扎后再通，應(yīng)力改變，層粘連蛋白、整合素α6β1隨之反應(yīng)性降低。隨著壓力進一步釋放，腮腺再生活躍，層粘連蛋白、整合素α6β1表達增高，證實了層粘連蛋白、整合素α6β1的高表達能夠促進腺體組織的增殖、分化與再生。LAM／ITGα6β1／FAK在腺體組織分化中作用現(xiàn)已被較多研究所發(fā)現(xiàn)，例如，Baek等［8］發(fā)現(xiàn)整合素α6β1在涎腺組織源性多能干細胞中高表達，并可作為其表面標志物，意味著唾液腺表達整合素α6β1細胞具有干細胞特性。另外，此期間整合素α6β1在導管基底膜的染色增厚，證實了導管系統(tǒng)可能在涎腺再生、發(fā)育過程中發(fā)揮干細胞作用［9－11］。在而FAK在導管結(jié)扎、腮腺萎縮過程中降低，再通后逐漸升高至正常水平，表明與FAK表達量始終與應(yīng)力變化、腮腺活動保持緊密相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示 LAM／ITGα6β1／FAK作為信號通路能夠?qū)Ч芙Y(jié)扎、再通產(chǎn)生的機械力變化作出反應(yīng)，在導管結(jié)扎誘導腮腺萎縮以及再通誘導腺體再生修復的過程中發(fā)揮重要作用，具體的內(nèi)在機制有待于進一步深入的研究。LAM／ITGα6β1／FAK通路可能為唾液腺萎縮性疾病的基因及再生治療提供新的靶點。