張周陽 劉富偉 辛河 賈雪連 寧小娜 張羽博翰 郭維維 張于凡 李云鵬 孔亮

高強度、頻繁的關(guān)節(jié)活動常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疲勞，造成關(guān) 節(jié)損傷，其發(fā)生率在軍事訓(xùn)練中可高達26.4%～35%，在運動員中高達 11%［1－2］。而異常咬合關(guān)系、習(xí)慣等帶來的不良應(yīng)力也常造成顳下頜關(guān)節(jié)損傷及相關(guān)疾?。?］。隨著材料科學(xué)與組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，水凝膠材料可降解性、藥物控釋、可控固化等多樣性能，可用于實現(xiàn)關(guān)節(jié)損傷的再生修復(fù)［4］。然而關(guān)節(jié)組織再生重建緩慢，且具有粘彈性，而非單純彈性形變的獨特承力特點，導(dǎo)致現(xiàn)有水凝膠材料本身或其在機體內(nèi)改建過程中難以承擔(dān)生理運動載荷，是制約水凝膠材料臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題［5］。由此，本研究將以明膠、透明質(zhì)酸這兩種臨床經(jīng)典材料為基材，在保有水凝膠再生修復(fù)與可控固化優(yōu)勢前提下，探索賦予材料粘彈性承力特點是否可以快速恢復(fù)損傷關(guān)節(jié)運動，為相關(guān)生物材料設(shè)計與疾病治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體重約250 g（第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心），SPF級飼養(yǎng)，自由進食水，12 h晝夜周期節(jié)律。實驗前進行跑動適應(yīng)性訓(xùn)練，放入滾輪內(nèi)，維持轉(zhuǎn)速0.12 m／s，每天分上下午訓(xùn)練15 min／次，連續(xù)5 d后將跑動能力強的8周齡大鼠挑出20只，進行分組和模型制備。

1.1.2 主要試劑與儀器 明膠、甲基丙烯酸酐、光引發(fā)劑、透明質(zhì)酸（上海國藥）；場發(fā)射掃描電鏡（Hitachi，日本）；小動物跑輪系統(tǒng)（第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科）；應(yīng)變儀與粘度檢測器（西北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院）。

1.2 方法

1.2.1 該新型光交聯(lián)粘彈性水凝膠（新型水凝膠）構(gòu)建 將明膠透析純化后加入甲基丙烯酸酐，混合均勻后發(fā)生加成反應(yīng)，隨后加入透明質(zhì)酸鈉粉末并混入光引發(fā)劑以形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，此時在常溫下保持為液態(tài)水凝膠。在波長365 nm紫外光（UV）照射2 min后即可固化。

1.2.2 結(jié)構(gòu)表征 光交聯(lián)固化后冰凍干燥1 d，抽真空、表面噴金后用掃描電鏡觀察其表面。

1.2.3 粘彈性表征 實驗組：新型水凝膠（具有明膠硬鏈網(wǎng)架結(jié)構(gòu)與透明質(zhì)酸軟鏈填充）；陰性對照組：單純明膠支架（僅有明膠硬鏈，但網(wǎng)架結(jié)構(gòu)相似）。分別使用應(yīng)變儀進行彈性模量檢測，使用粘度檢測器進行粘度檢測，以分析新型水凝膠粘彈性特點。

1.2.4 大鼠關(guān)節(jié)損傷模型構(gòu)建 實驗組與陰性對照組同上，增加空白對照組（造模但不修復(fù)）、商業(yè)對照組（臨床用于緩解關(guān)節(jié)損傷癥狀的經(jīng)典透明質(zhì)酸注射劑，間隔1周注射）。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.167 mL／100 g體重），碧藍麻（單側(cè)關(guān)節(jié) 0.1 mL）關(guān)節(jié)腔注射局部麻醉。為避免健肢代償性運動，采取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)造模，進行同分組處理。膝關(guān)節(jié)周圍脫毛，常規(guī)消毒后鋪巾。于膝關(guān)節(jié)外側(cè)切開皮膚并由外向內(nèi)脫臼髕骨，此時于關(guān)節(jié)正中切開關(guān)節(jié)囊，可充分暴露關(guān)節(jié)軟骨、半月板等結(jié)構(gòu)。在股骨滑車處，用直徑3 mm的環(huán)鉆垂直鉆孔深度2 mm，保證足量、持續(xù)生理鹽水沖洗降溫，隨后離斷并摘除半月板。注入液態(tài)材料后用365 nm波長紫外光照射2 min，確保損傷修復(fù)平整處無活動性出血。而后依次縫合關(guān)節(jié)囊、皮膚，常規(guī)飼養(yǎng)。各組于術(shù)后1周進行行為學(xué)檢測，2月后取材進行組織學(xué)檢測。

1.2.5 滾輪運動測試術(shù)后1周，待切口愈合后，將各分組大鼠置放于小動物跑輪系統(tǒng)內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速0.12 m／s后，于前方30 cm處放置相機進行拍攝，觀測并記錄大鼠出現(xiàn)抗拒跑動行為的時間，間隔4 h后重復(fù)觀測，反復(fù)3遍。

1.3 組織學(xué)檢測

術(shù)后2月取材，取材后用PBS沖洗組織，置于40 g／L多聚甲醛固定36 h備用。采用EDTA脫鈣液常規(guī)脫鈣4周，石蠟包埋后沿股骨滑車前后方向連續(xù)切片，厚度4μm，常規(guī)HE、番紅O染色，顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果使用Origin 2021統(tǒng)計軟件進行分析、作圖，組間差異比較使用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新型水凝膠材料性能表征

常溫下該新型水凝膠成液體，具有流動性，材料表面與水平面平行（圖1A），篩選固化參數(shù)后，最終確定2 min為單次固化標(biāo)準(zhǔn)時間，此時有效固化深度約為3 mm。在365 nm波長UV照射后，材料表面與容器底部平行（圖1B）。掃描電鏡可見該水凝膠固化后呈現(xiàn)網(wǎng)狀、均勻、多孔樣結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)均勻填塞透明質(zhì)酸（圖1C）。同時，分別對實驗組和陰性對照組進行粘彈性承力檢測后發(fā)現(xiàn)，無論代表材料彈性的儲能模量（圖1D），還是代表材料粘性的損耗模量（圖 1E），實驗組均高于陰性對照組，表明實驗組材料具有粘彈性力學(xué)特點。最后，進行材料粘度檢測，以比較材料抗剪切力的性能，發(fā)現(xiàn)實驗組的粘度高于對照組（圖1F）。

圖1 光交聯(lián)粘彈性水凝膠材料性能表征Fig 1 Characterization of photocross-linked viscoelastic hydrogel

2.2 新型水凝膠對動物損傷關(guān)節(jié)運動的恢復(fù)效果

造模術(shù)如圖 2所示。術(shù)后動物無感染、無死亡。術(shù)后1周進行行為學(xué)檢測，2月進行組織學(xué)檢測。

圖2 大鼠關(guān)節(jié)損傷模型建立Fig 2 Establishment of joint injury model in rats

錄像數(shù)據(jù)分析顯示，空白組大鼠率先停止了跑動，緊扒在滾輪上（圖3），隨后是陰性對照組與商業(yè)對照組，姿態(tài)從跑動變化為跳動，隨后停下，也緊扒在滾輪上（圖3）。實驗組在持續(xù)運動20min后依然能維持跑動姿態(tài)，并且在重復(fù)3次后均出現(xiàn)同樣的表現(xiàn)（圖3）。進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計后，實驗組的單次極限運動時間遠(yuǎn)超過其他對照組（圖3）。

圖3 大鼠運動能力檢測Fig 3 Comparison of motor ability of rats

2.3 新型水凝膠在體轉(zhuǎn)歸效果

見圖4。HE與番紅O染色觀察發(fā)現(xiàn)，空白組關(guān)節(jié)缺損嚴(yán)重，出現(xiàn)斷崖式凹坑，關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨結(jié)構(gòu)破壞，缺損區(qū)內(nèi)無軟骨細(xì)胞，而被纖維組織覆蓋；陰性對照組也出現(xiàn)斷崖式凹坑，但存在部分結(jié)構(gòu)不良的軟骨組織；商業(yè)對照組具有一定的關(guān)節(jié)修復(fù)效果，表面具有一定厚度的軟骨層，依舊軟骨下骨結(jié)構(gòu)不良，整體缺損仍呈凹坑狀；實驗組動物關(guān)節(jié)面平整，關(guān)節(jié)軟骨厚度恢復(fù)較好，其中分布大量軟骨細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)邊界清晰，基本實現(xiàn)關(guān)節(jié)損傷區(qū)的再生與改建。

圖4 缺損區(qū)組織學(xué)染色觀察 （×250）Fig 4 The histological observation of the defect area （×250）

3 討 論

關(guān)節(jié)的承力功能和組織結(jié)構(gòu)，與所受力學(xué)載荷大小、周期、角度等參數(shù)息息相關(guān)［6］。在軍事活動中，空降兵在跳傘落地時，關(guān)節(jié)常受到地面的直接沖擊或與裝備發(fā)生撞擊，其中顳下頜關(guān)節(jié)損傷及膝關(guān)節(jié)軟骨缺損是較嚴(yán)重表現(xiàn)。更有文獻指出，在某部傷殘軍人中，骨與關(guān)節(jié)損傷占比高達70.61%，嚴(yán)重影響我軍戰(zhàn)斗力［7］。

恢復(fù)損傷關(guān)節(jié)運動是臨床治療核心。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸是緩解關(guān)節(jié)損傷癥狀的經(jīng)典方案。然而癥狀雖緩解但損傷依舊會不斷加重［8］。自體軟骨是修復(fù)材料中的金標(biāo)準(zhǔn)，但來源局限、適應(yīng)癥窄，臨床應(yīng)用局限［9］。異體或異種軟骨目前仍未能根本上解決存儲、脫敏等核心工藝，應(yīng)用較少［10－11］。近年來學(xué)者們開發(fā)多種新型材料以期實現(xiàn)損傷關(guān)節(jié)的再生修復(fù)，形成類天然組織，以恢復(fù)生理運動狀態(tài)［12］。然而目前相關(guān)研究主要集中于提升材料生物活性，對生理運動中的力學(xué)性能卻關(guān)注不足［13］。這導(dǎo)致大量生物材料缺乏生物力學(xué)設(shè)計，材料本身或修復(fù)改建過程中難以承擔(dān)生理運動載荷［14］。近年來有學(xué)者提出，關(guān)節(jié)尤其是表面軟骨組織具有粘彈性承力特性，而非傳統(tǒng)理解上的單純彈性形變，賦予材料適當(dāng)粘彈性將進一步促進組織再生［15］。

由此，本實驗構(gòu)建了一種新型水凝膠，在保有水凝膠材料再生修復(fù)與可控固化優(yōu)勢條件下，進一步賦予材料粘彈性承力特點。實驗證實該新型水凝膠可快速恢復(fù)大鼠損傷關(guān)節(jié)運動功能，使術(shù)后初始運動時間由6周后可做簡單活動，提升到1周可跑動，效果遠(yuǎn)超非粘彈性材料與現(xiàn)有臨床使用的透明質(zhì)酸注射治療。該新型材料的構(gòu)建方法一定程度上模擬了天然軟骨中II型膠原與蛋白聚糖間的作用關(guān)系。同時，本研究也希望利用兩種材料體內(nèi)代謝速度差異，維持修復(fù)區(qū)域力學(xué)性能穩(wěn)定。最后，由于關(guān)節(jié)損傷個體差異大，本研究借鑒光固化樹脂修復(fù)牙齒缺損思路，使其經(jīng)2 min照射即可具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，并可滿足分層固化要求，未來有望在關(guān)節(jié)鏡等技術(shù)輔助下實現(xiàn)相關(guān)疾病的微創(chuàng)治療。以上設(shè)計理念及實驗結(jié)果共同表明，力學(xué)性能應(yīng)納入關(guān)節(jié)修復(fù)材料設(shè)計，對快速恢復(fù)損傷關(guān)節(jié)功能意義重大。