陳冬雪 白喜龍 梁英民

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和一定分化潛能的細(xì)胞，在特殊條件下可分化成成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等多種功能性細(xì)胞［1］。2000年 Gronthos等［2］從人的第三磨牙中提取并分離出牙髓干細(xì)胞，作為牙髓組織中的一類成體干細(xì)胞，免疫表型與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，主要表達(dá) CD29、CD90、CD105等多種分子標(biāo)記。牙髓干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，有利于組織再生或微環(huán)境的修復(fù)，并具有高度增殖能力及克隆形成能力而成為組織工程研究中的一類新型種子細(xì)胞［3］。牙髓組織塊較小且經(jīng)過(guò)有限的體外培養(yǎng)后細(xì)胞趨于衰老，故而用于科學(xué)研究的干細(xì)胞數(shù)量成為一大難題。

細(xì)胞永生化是指細(xì)胞由于自身基因的變化或在外界因素刺激的條件下，使細(xì)胞避免衰老死亡的過(guò)程以獲得無(wú)限增殖的能力［4］。目前細(xì)胞永生化的主要機(jī)制包括端粒酶的激活、病毒基因的轉(zhuǎn)染以及抑制抑癌基因的表達(dá)等方法［5－6］。本實(shí)驗(yàn)將外源性猴腎病毒SV40的大T抗原（LT）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入牙髓干細(xì)胞中，使抑癌基因無(wú)法表達(dá)，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)獲得永生，為進(jìn)一步的研究提供細(xì)胞來(lái)源［7］。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

I型膠原酶（Gibco公司，美國(guó)）；Diapase酶（Roche公司，瑞士）；RNAiso Plus、Real-time PCR試劑盒購(gòu)（TAKARA公司，日本）；CD29、CD34、Flag、GAPDH、等抗體（abcom公司，英國(guó)）；三系分化試劑盒（cyagen公司，美國(guó)）；HBLV-SV40T-3*flag-PURO病毒、Polybrene［漢恒生物科技（上海）有限公司］。

1.2 牙髓干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

收集第三磨牙，劈開(kāi)牙冠取出牙髓，PBS液反復(fù)沖洗剪成小塊，向組織塊中加入3 g／L I型膠原酶和4 g／L Dispase酶的混合液消化45 min，加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后離心并棄上清，重復(fù)3次吸出組織塊接種于培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加含有15%FBS的培養(yǎng)基放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁后，平均每3 d換液。

1.3 牙髓干細(xì)胞的鑒定

成骨誘導(dǎo)：取P3代DPSC消化后制備成細(xì)胞懸液，按試劑盒操作，每3 d換液1次，誘導(dǎo)3周后行茜素紅染色，光鏡下觀察并拍照。

成脂誘導(dǎo)：取P3代DPSC消化后制備成細(xì)胞懸液，按試劑盒操作，3周進(jìn)行油紅O染色，光鏡下觀察并拍照。

成軟骨誘導(dǎo)：取P3代DPSC消化后制備成細(xì)胞懸液，按試劑盒操作，誘導(dǎo)4周后切片行阿利辛藍(lán)染色，光鏡下觀察并拍照。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記物：取P3代DPSC，制備成7個(gè)細(xì)胞數(shù)量為1×106的細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD29、CD73、CD105的表達(dá)，利用軟件進(jìn)行分析。

1.4 病毒感染

牙髓干細(xì)胞按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中。HBLV-SV40T-3*flag-PURO病毒溶液20μL（滴度為 1×108TU／mL）按 MOI＝100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，感染后第2天（約24 h），吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在感染72 h之后換上適當(dāng)濃度Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株，并將其命名為immortalized dental pulp stem cells（iDPSCs）。

1.5 目的基因SV40-LT的RT-PCR檢測(cè)

提取iDPSC細(xì)胞總RNA，定量后用1μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，冰上配置20μL合成體系，1μL cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量引物序列為SV40-LT-F5′-GAATTCGCCACCATGGATAAAGTTTTAAACA-3′，SV40-LT-R 5′-GGATCCTGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGT-3′。內(nèi)參為 GAPDH。熒光染料采用 SYBR premix Ex Taq進(jìn)行。循環(huán)條件為95℃30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束，整理熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用相對(duì)定量的方法確定目的基因SV40-LT的表達(dá)情況。

1.6 Western blot檢測(cè)iDPSCs中標(biāo)簽蛋白的表達(dá)

以iDPSCs為實(shí)驗(yàn)組，正常DPSCs為對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)簽蛋白檢測(cè)。RIPA裂解液裂解蛋白提取蛋白，上樣15μg于濃度為10%分離膠中進(jìn)行電泳，待指示帶跑出膠體外停止電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，條件為250 mA，轉(zhuǎn)膜100 min，隨后進(jìn)行封閉及Flag一抗過(guò)夜孵育（1∶1 000），封二抗（1∶5 000）2 h，洗膜，顯影。

1.7 iDPSCs干性的測(cè)定

對(duì)獲得的iDPSC進(jìn)行多向分化潛能的測(cè)定及干細(xì)胞表面標(biāo)記物的檢測(cè)，具體步驟如上。

2 結(jié) 果

2.1 DPSCs分離與培養(yǎng)

將牙髓組織塊接種于塑料培養(yǎng)皿中，1周后開(kāi)始有DPSC從組織塊中爬出貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞大多呈梭形細(xì)胞樣，3周后可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代后生長(zhǎng)良好，約1周達(dá)到90%匯合，平均5 d可傳代1次 （圖1）。

圖1 SV40-LT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)前、后牙髓干細(xì)胞的形態(tài) （×40）Fig 1 Cell morphology of DPSCs and Lenti-virus containing SV40-LT gene infected DPSCs （×40）

2.2 DPSCs與 iDPSCs的鑒定

2.2.1 流式細(xì)胞分析 將分離培養(yǎng)的DPSCs及永生化后的iDPSCs培養(yǎng)擴(kuò)增后，用標(biāo)記的流式抗體檢測(cè)DPSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離的DPSCs及 iDPSCs均表達(dá) MSC標(biāo)志物 CD29、CD73、CD105，但不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34（圖2）。

圖2 DPSCs與iDPSCs各表面標(biāo)志物的分布（流式細(xì)胞術(shù)）Fig 2 The expression of CD29，CD73，CD105 of DPSCs and iDPSCs（Flow cytometry）

2.2.2 成骨誘導(dǎo) 在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3周后形成礦化組織，茜素紅染色呈陽(yáng)性（圖3）。

2.2.3 成脂誘導(dǎo) 在成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)初期，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變圓，誘導(dǎo)3周時(shí)，油紅O染色陽(yáng)性，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有脂滴（圖3）。

2.2.4 軟骨誘導(dǎo) 在體外經(jīng)軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3周后，行阿利新藍(lán)染色，如圖3可見(jiàn)，細(xì)胞被藍(lán)染，。說(shuō)明所得細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

圖3 DPSC與iDPSC多向分化潛能的鑒定Fig 3 The identifition of Multi-lineage differentiation of DPSCs and iDPSCs

2.3 病毒感染后iDPSCs的形態(tài)觀察

細(xì)胞被病毒感染后，僅有小數(shù)量細(xì)胞死亡，在加入嘌呤霉素2 d后細(xì)胞開(kāi)始死亡，待7～10 d后未感染組細(xì)胞全部死亡，此時(shí)將嘌呤霉素濃度減半維持篩選，3～5 d后細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)，形態(tài)上與感染前細(xì)胞相比有所差別，形態(tài)為長(zhǎng)梭形似成纖維細(xì)胞樣（圖1）。

2.4 SV40-LT mRNA表達(dá)檢測(cè)

由RT-PCR得出的目的基因SV40-LT與內(nèi)參基因GAPDH Ct值的比較，利用雙ΔCT法得出循環(huán)期間擴(kuò)增產(chǎn)物量的倍數(shù)變化（圖4）。SV40-LT基因的表達(dá)在永生化細(xì)胞中明顯高于對(duì)照組細(xì)胞（P＜0.05），說(shuō)明SV40-LT基因成功轉(zhuǎn)入。

圖4 SV40-LT mRNA表達(dá)（RT-PCR）Fig 4 SV40-LT mRNA expression of DPSCs and iDPSCs（RTPCR）

2.5 iDPSC標(biāo)簽蛋白檢測(cè)

蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，感染組細(xì)胞在70KD見(jiàn)顯著特異性條帶，為Flag標(biāo)簽蛋白（圖5）。

圖5 標(biāo)簽蛋白的表達(dá)（Western blot）Fig 5 Flag protein expression（Western blot）

3 討 論

近年來(lái)，牙髓干細(xì)胞因具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性而備受關(guān)注，大量研究表明，干細(xì)胞可通過(guò)自身的旁分泌機(jī)制來(lái)促進(jìn)傷口的愈合以及組織的再生［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，首先成功分離了牙髓干細(xì)胞，通過(guò)HBLV-SV40LT-3*flag-PURO慢病毒的感染及抗生素的篩選建立了可以穩(wěn)定傳代并保持了原代干細(xì)胞特性的永生化細(xì)胞系，對(duì)未來(lái)牙髓干細(xì)胞的繼續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。目前獲得的iDPSC在體外可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，如今已傳至30代，而在相同培養(yǎng)條件下原代DPSC僅能培養(yǎng)至10代左右。

本實(shí)驗(yàn)采用的慢病毒載體導(dǎo)入SV40LT基因，是因慢病毒感染效率較高，免疫反應(yīng)小且不會(huì)產(chǎn)生新的病毒安全性較好。而SV40LT可引起多種細(xì)胞的永生化且調(diào)控機(jī)制較為清楚，是最常用的永生化基因，將其整合入靶細(xì)胞核內(nèi)并表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力的改變［9］，由于永生化細(xì)胞是體細(xì)胞向癌細(xì)胞過(guò)渡的中間態(tài)，其在體內(nèi)的安全性受到質(zhì)疑。也許是因?yàn)橥庠诓《净虻膶?dǎo)入導(dǎo)致iDPSC的細(xì)胞形態(tài)較原代細(xì)胞相比有所差異。誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示iDPSC具有多向分化潛能，提示永生化的牙髓干細(xì)胞是一把雙刃劍。

誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示DPSC與iDPSC均具有較強(qiáng)的成骨及軟骨分化能力，目前有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以很好的緩解骨質(zhì)疏松的癥狀［10］，DPSC或許是治療骨質(zhì)疏松的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞源。Li等［11］認(rèn)為hDPSC作為自體骨組織工程細(xì)胞具有很好的應(yīng)用價(jià)值。Gronthos等［12－13］通過(guò)比較 DPSC與 BMSC的增值情況，發(fā)現(xiàn)DPSC在同樣細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的克隆數(shù)量至少是BMSC的10倍以上，說(shuō)明DPSC具有更高的集落形成能力和增殖能力。DPSC來(lái)源于外胚層，其向神經(jīng)譜系分化的能力較其他胚層來(lái)源的細(xì)胞強(qiáng)，取材方便并可以冷凍低溫保存［14］。DPSC通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的方式阻止細(xì)胞的凋亡，并可分化為神經(jīng)功能性細(xì)胞促進(jìn)其修復(fù)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［15］。Mead等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hDPSC與hBMSC以及hAMSC相比較具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用［16］。

DPSC對(duì)牙組織、骨組織以及神經(jīng)組織的修復(fù)具有很好的療效，但DPSC仍面臨多種問(wèn)題，如DPSC目前尚無(wú)特異性的表面標(biāo)記物，DPSC的相關(guān)研究大多數(shù)為細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在臨床應(yīng)用上還存在很大的空白。而牙髓干細(xì)胞條件培養(yǎng)液可對(duì)多種疾病模型有治療能力，研究者認(rèn)為可能是干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子的共同作用發(fā)揮功能，即是因子的分泌量很低也不容忽視［17－19］。目前對(duì)于iDPSC各種因子的分泌量是未知的，希望通過(guò)對(duì)iDPSC中細(xì)胞因子表達(dá)量的確定對(duì)iDPSC的條件培養(yǎng)液加以利用。