徐博雅 宋文 何奕德 李哲 張玉梅

納米粒子廣泛應(yīng)用于藥物靶向遞送、分子成像和組織工程等領(lǐng)域，其中金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）由于它們獨(dú)特的光電化學(xué)特性和良好的生物相容性備受關(guān)注［1］。研究表明，AuNPs是非常有吸引力的成骨材料，對(duì)骨改建相關(guān)的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用顯著［2－3］。因此，將 AuNPs引入牙種植體表面，可能是骨組織工程領(lǐng)域中極具吸引力的材料。

本研究設(shè)計(jì)并通過電沉積方式在鈦表面納米管上構(gòu)建尺寸可控的金納米粒子（AuNPs／NTs），評(píng)估該表面對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞功能的影響，為鈦種植體表面功能修飾提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

丙酮、無水乙醇、40%氫氟酸、85%磷酸（天津富宇精細(xì)化工）；MC3T3-E1細(xì)胞系（ATCC，美國(guó)）；α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清、青霉素－鏈霉素、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒（PCM，美國(guó)）；基因引物（北京擎科澤西）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒（TaKaRa，日本）；BCIP／NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒；茜素紅（Sigma，美國(guó)）。

1.2 AuNPs／NTs的構(gòu)建與表征

陽極氧化制備NTs：直徑為 1.5 cm，厚度為1 mm的圓形鈦片用砂紙進(jìn)行打磨至表面呈光滑鏡面，作為PT組。在400 mL去離子水中加入23 mL 85%的磷酸溶液和5 mL氫氟酸溶液制備電解液，在10 V電壓下陽極氧化法制備納米管，氧化時(shí)間1 h，作為NT組。

電沉積制備 AuNPs／NTs：以 NTs為工作電極，鉑片為輔助電極，極間距 30 mm，在 0.1 mol／L HAuCL4／0.2 mol／L HBO3溶液中以5 V恒電壓沉積，電沉積時(shí)間分別設(shè)置為5、10、30、60 min。沉積完畢后采用丙酮、無水乙醇、異丙醇、去離子水超聲清洗。

材料表征：采用掃描電鏡SEM對(duì)制備完成的試樣進(jìn)行表面觀察。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠前體成骨細(xì)胞MC3T3-E1使用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，添加100 U／mL青霉素和鏈霉素培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到密度約80%后，采用胰蛋白酶消化傳代、接種試樣。成骨誘導(dǎo)液在生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 0.108 g／mLβ-甘油磷酸鈉（β-GP），50 μg／mL抗壞血酸（Vc）和 0.2μg／mL地塞米松。

1.4 細(xì)胞增殖功能檢測(cè)（CCK-8實(shí)驗(yàn)）

將PT、NT和電沉積10 min制備的AuNPs／NTs放置于24孔板內(nèi)，不含細(xì)胞的孔作為空白組，PT和NT作對(duì)照組，細(xì)胞以1×104／孔的密度接種到試樣表面。每孔加入1 mL的α-MEM，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，分別在接種后的第1天、第3天、第5天及第7天進(jìn)行測(cè)定。每孔中更換成500μL含10%CCK-8的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，利用酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國(guó)）測(cè)定每孔450 nm處的吸光度。

1.5 成骨相關(guān)基因檢測(cè)（RT-PCR）

細(xì)胞接種到不同試樣表面貼壁1 d后更換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)3 d，每孔加入200μL Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA。利用 Nanodrop 2000（Thermo，美國(guó)）測(cè)定提取的細(xì)胞總RNA的濃度及純度，使用TAKARA的prime script RT試劑盒反向轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，CFX96聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)（Bio-rad，USA）進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)使用TB Green?Premix Ex Taq II反應(yīng)體系，兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序（Step 1：95℃變性30 s，Step 2：PCR反應(yīng)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，Step 3：95℃退火5 s，60℃延伸30 s）。目的基因包括堿性磷酸酶ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 Runx2（runt-related transcription factor 2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 BMP-2（bone morphogenetic protein-2）、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體Osterix，骨橋蛋白 OPN（osteopontin）。管家基因選取GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），其引物序列及各目的基因的引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 RT-PCR primer sequences for RT-PCR

1.6 堿性磷酸酶（ALP）染色

細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后。采用BCIP／NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒對(duì)ALP進(jìn)行染色，每孔加入染色液200 μL室溫避光孵育過夜。加入去離子水中止染色后，取出材料置于體式顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 細(xì)胞外礦化基質(zhì)染色及半定量分析

細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后棄去培養(yǎng)液，每孔加入500 μL茜素紅染液，室溫避光孵育5 min，加入去離子水中止染色，體式顯微鏡拍照觀察。隨后向各個(gè)孔中加入氯化十六烷基吡啶的洗脫液震蕩30 min洗脫，使用酶標(biāo)儀測(cè)定620 nm處洗脫液的A值并進(jìn)行比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 試樣表面觀察

圖1在為NTs上進(jìn)行納米金電沉積的SEM圖像以及AuNPs直徑與沉積時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示AuNPs大小具有時(shí)間依賴性，隨沉積時(shí)間延長(zhǎng)而生長(zhǎng)，且當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至30 min，留存在NTs陣列內(nèi)的AuNPs受到納米管管徑的限制，尺寸不再發(fā)生明顯變化。發(fā)現(xiàn)電沉積10 min組的AuNPs／NTs表面金顆粒大小均勻且結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，經(jīng)篩選用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中記錄為AuNPs／NTs組。

圖1 不同沉積時(shí)間鈦表面AuNP／NTs陣列的FE-SEM俯視圖和橫截面圖像Fig 1 FE-SEM top and cross-sectional images of AuNP／NTs arrays on titanium surface at different deposition times

2.2 AuNPs／NTs對(duì)細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，成骨細(xì)胞在AuNPs／NTs表面接種培養(yǎng)，其數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)增殖。與PT組和NT組相比，雖然在培養(yǎng)第5、第7天后AuNPs／NTs表面的成骨細(xì)胞數(shù)稍有降低，但各時(shí)間點(diǎn)A值均未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05），表明 AuNPs／NTs材料納米管及 Au的加入都不會(huì)降低其細(xì)胞增殖活性。

圖2 MC3T3-E1細(xì)胞在3組樣本表面的增殖活力（CCK-8法）Fig 2 The proliferation viability of MC3T3-E1 cells on the surface of the sample of the 3 groups（CCK-8 assay）

2.3 AuNPs／NTs對(duì)細(xì)胞成骨基因表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與PT組相比，AuNPs／NTs組BMP-2表達(dá)量明顯增加（圖 3）（P＜0.01），Osterix和OPN與表達(dá)量減少（P＜0.05）。與NT組相比AuNPs／NTs組細(xì)胞 BMP-2和Osterix的表達(dá)上調(diào)了1.5倍（P＜0.05），OPN基因的表達(dá)上調(diào)了 1.2倍（P＜0.01），差異均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外ALP和Runx2基因的表達(dá)也有一定上調(diào)，但結(jié)果未顯示出無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 RT-PCR檢測(cè)AuNPs／NTs對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 3 The effect of AuNPs／NTs on osteogenesis-related gene expression in MC3T3-E1 cells

2.4 AuNPs／NTs對(duì)細(xì)胞成骨向分化的影響

體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)各組均見深藍(lán)色堿性磷酸酶結(jié)晶（圖 4）。與PT組和NT組相比，AuNPs／NTs組可以觀察到更多的深藍(lán)色結(jié)節(jié)。茜素紅溶液染色觀察發(fā)現(xiàn)各組均可見深紅色礦化結(jié)節(jié)（圖 5）。其中AuNPs／NTs組表面顯示出更多的礦化結(jié)節(jié)，且顏色最深。PT組表面的礦化結(jié)節(jié)最少。通過對(duì)礦化結(jié)節(jié)洗脫后測(cè)定620 nm處吸光度的半定量分析（圖5），顯示AuNPs／NTs組誘導(dǎo)小鼠MC3T3細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力最強(qiáng)，且顯著高于PT組和NT組，PT組和NT組間半定量結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 不同材料表面MC3T3細(xì)胞ALP染色Fig 4 ALP staining of MC3T3 cells on different material surfaces

圖5 不同材料表面MC3T3細(xì)胞茜素紅染色及半定量分析Fig 5 Alizarin red staining of MC3T3 cells on the surface of different materials

3 討 論

促進(jìn)種植體周圍骨組織再生是提高種植體的存活率的關(guān)鍵。金納米粒子以其優(yōu)異的低細(xì)胞毒性和高生物相容性廣泛應(yīng)用于生物診斷、藥物遞送等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［4－5］。金納米粒子能與成骨細(xì)胞相互作用，促進(jìn)新骨沉積［6］，同時(shí)在骨改建的過程中抑制破骨分化［7］?；谶@些原因，我們制備了AuNPs功能化的鈦納米管種植體，以促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，為增進(jìn)口腔種植體的骨組織結(jié)合提供依據(jù)。

AuNPs的制備工藝多樣，目前常用的方法有化學(xué)還原方法［8］以及沉積［9－11］、濺射［12］等物理方法，其中電化學(xué)還原沉積法技術(shù)成熟［13］?；驹硎请娊赓|(zhì)中的Au3＋在多孔的納米模板表面得到電子還原形成金體。本研究發(fā)現(xiàn)隨著沉積時(shí)間的延長(zhǎng)，位于納米管內(nèi)的金納米球表現(xiàn)出生長(zhǎng)受限，提示納米管狀陣列對(duì)金的生長(zhǎng)起到一定的空間限制作用。

Zhang等［14］發(fā)現(xiàn)20 nm和40 nm的 AuNPs提高人牙周膜祖細(xì)胞成骨向分化，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成；Ko等［15］在不同尺寸中篩選出30 nm和50 nm的AuNPs促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化最為有效。在本研究中，使用了直徑為50 nm的鈦納米管作為電沉積的模板，并在其上合成出平均直徑在30～50 nm的金納米粒子。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AuNPs／NTs可以顯著增加成骨分化特異性標(biāo)記物如 BMP-2，Osterix和OPN基因的表達(dá)。BMP-2是TGF-β超家族中的骨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子［16］。有研究表明，AuNPs可能作為機(jī)械刺激激活 MAPK信號(hào)通路，促進(jìn) BMP-2／smad／Runx2信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨［17－18］。OPN與 Osterix是骨基質(zhì)的形成所必需的特異性轉(zhuǎn)錄因子［19］，Osterix可以受到BMP-2通過Dlx5誘導(dǎo)而表達(dá)升高［20］。盡管在PCR檢測(cè)的早期（3 d）由于時(shí)間原因，BMP-2和Runx2表達(dá)升高，而ALP的表達(dá)未形成顯著累積。但基于7 d的 ALP／AKP染色結(jié)果認(rèn)為，AuNPs／NTs組染色更深代表堿性磷酸酶的活性更高。此外，AuNPs／NTs組顯示出明顯高于其他組的鈣結(jié)節(jié)沉積。由此可見相比于光滑表面和純納米管表面材料，AuNPs的摻入促進(jìn)成骨向分化，可用作促進(jìn)骨整合的牙種植體表面修飾，以改善種植體植入后的骨形成。

本研究在良好的二氧化鈦納米管制備工藝基礎(chǔ)上，探索了電沉積形成AuNPs的相關(guān)特征及生物學(xué)功效，為鈦種植體表面功能化修飾提供了新的研究方向。此外，本研究尚存在不足之處，對(duì)于納米管徑限制AuNPs生長(zhǎng)的規(guī)律探索不夠清楚，且AuNPs促進(jìn)成骨分化的機(jī)制尚有待進(jìn)一步的探索。