鄭立娟 李浩然 劉健偉

慢性根尖周炎是由細(xì)菌及其毒素引起的炎癥和免疫反應(yīng)，其主要病理表現(xiàn)為根尖周正常組織結(jié)構(gòu)破壞，根尖附近的牙槽骨吸收。大量炎癥細(xì)胞在炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和酶釋放后被激活，導(dǎo)致根尖組織破壞，形成炎性肉芽組織［1－2］。試圖尋找一些藥物，作為輔助常規(guī)根管治療的一種手段，促進(jìn)根尖骨質(zhì)修復(fù)，已經(jīng)成為臨床根尖周炎治療的迫切需要。

辛伐他汀是競爭性3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，這種藥物在抑制肝內(nèi)膽固醇生物合成過程中起重要作用，進(jìn)而可以降低血清中膽固醇濃度。進(jìn)而降低心臟病等多種心血管疾病的發(fā)生概率，一直應(yīng)用于心血管疾病的預(yù)防和治療。近年研究表明，辛伐他汀能促進(jìn)骨細(xì)胞生長分化、增加骨密度等，對骨形成有積極作用［3］，但其作用機(jī)制尚未完全明確。

Cyr61（cysteine-rich protein 61）是 CCN家族中最有代表性的成員之一，具有廣泛的生物學(xué)功能［4］，在胚胎、腎臟、心臟、肝臟、和骨骼肌等多種組織均有表達(dá)。以往研究表明，Cyr61在諸如腫瘤、血管性疾病、纖維化疾病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［5］。有研究表明，Cyr61／CCN1主要在骨組織中表達(dá)和發(fā)揮作用［6］。如果Cyr61的表達(dá)被抑制，骨折的愈合過程也將減緩［7］。并且可以作為下游基因，調(diào)控牙髓干細(xì)胞的增殖和遷移。但其在牙齒根尖骨質(zhì)修復(fù)過程中是否起有一定作用，國內(nèi)鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察辛伐他汀對大鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HMSCs）中 Cyr61表達(dá)的影響，評估Wnt通路對其的誘導(dǎo)作用，探討辛伐他汀與實(shí)驗(yàn)性根尖周炎疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 SD大鼠，體重為（240±30）g（大連醫(yī)科大學(xué)SPF）。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）；LPS內(nèi)毒素、醋酸纖維素薄膜（NC薄膜，Sigma公司，美國）；青鏈霉素工作液、胎牛血清 （Gibco公司，美國）；堿性磷酸酶檢測試劑盒、蛋白裂解液、胰蛋白酶 （北京碧云天生物技術(shù)公司）；Cyr61抗體、Wnt抗體、β-catenin抗體、GAPDH抗體 （武漢三鷹生物有限公司）；辛伐他?。ㄉ虾＿h(yuǎn)慕生物）；蛋白marker（Thermo Fisher公司，美國）；HMSCs（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；脫脂奶粉（BD公司，美國）。

1.1.3 主要儀器 便攜式牙鉆機(jī) （佛山興斯醫(yī)療器械有限公司）、Trophy，1／4球鉆 （直徑 0.5 mm）；二氧化碳細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，美國）；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（重慶竟邁科技有限公司）；2518R高速冷凍離心機(jī)（日立公司，日本）；熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）；高溫高壓滅菌鍋（松下醫(yī)療器械，日本）；酶標(biāo)儀（珀金埃爾默有限公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 建立牙根尖周炎動(dòng)物模型 32只大鼠隨機(jī)分組。用小號(hào)球鉆在大鼠第一磨牙處鉆入，至有落空感時(shí)停止，觀察出血點(diǎn)，提前準(zhǔn)備好浸泡過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的脫脂棉，放入出血點(diǎn)。等待麻藥失效，分組飼養(yǎng)。動(dòng)物分組方式：A組（對照組8只）：開髓，分別于2周末和3周末處死4只觀察建模情況；C組（實(shí)驗(yàn)組16只）：開髓后，8只大鼠于3周末開始每日生理鹽水灌胃，至5周末處死；8只大鼠于3周末開始每天辛伐他汀灌胃給藥，劑量為5 mg／kg·d，至5周末處死。所有處死的大鼠剝離下頜骨，儲(chǔ)存于4%多聚甲醛溶液中。

1.2.2 Micro-CT 掃描處死大鼠，取下頜骨置于含4%多聚甲醛的福爾馬林溶液中固定，Micro-CT儀器進(jìn)行掃描并觀察牙根尖骨缺損和成骨情況，掃描條件為90 kV以及110 mA，掃描分辨率為20μm。并用Mimic Research統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

1.2.3 HE染色 大鼠下頜骨組織脫鈣后進(jìn)行病理切片，分別用蘇木精染液和伊紅染液對組織進(jìn)行染色，蒸餾水洗滌后進(jìn)行脫水和封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HMSCs使用10%FBS與DMEM高糖培養(yǎng)基1∶1培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度為90%左右時(shí)進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)分組情況：A組：常規(guī)培養(yǎng)；B組：A組＋10－7mol／L辛伐他汀；C組：A組＋10－5mol／L辛伐他汀。

1.2.5 堿性磷酸酶檢測 細(xì)胞接種于6孔板，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，收集細(xì)胞裂解緩沖液，根據(jù)ALP檢測試劑盒要求配制空白對照品、標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液。37℃孵育5～10min。加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品或有堿性磷酸酶活性的孔會(huì)出現(xiàn)深淺不同的黃色。在405 nm測定吸光度值，記錄結(jié)果。

1.2.6 Western blot法檢測 Wnt、β-catenin和 Cyr61蛋白表達(dá)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行加藥處理，提取細(xì)胞總蛋白，定量及高溫變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。安裝電泳裝置，按照濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V的條件進(jìn)行電泳，根據(jù)蛋白Marker分離情況及時(shí)停止電泳。切取所測樣本分子量范圍分離膠，恒流250mA轉(zhuǎn)膜，到時(shí)間后，取出NC膜，封閉在新配制的5%的脫脂奶粉中。滴加稀釋后的一抗溶液（Wnt，1∶500；β-catenin，1∶1 500；Cyr61，1∶1 000），4℃冰箱過夜孵育。次日于搖床上用TBST溶液洗膜4次，每次10 min，將NC膜放入濕盒中孵育二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜。將發(fā)光液A、B以1∶1比例混合，放入顯影儀進(jìn)行發(fā)光，對樣本條帶記錄分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠根尖周炎模型病灶Micro-CT掃描影像分析

開髓術(shù)后3周末時(shí)，病灶組織體積明顯增大，此時(shí)是根尖周炎癥發(fā)展的高峰期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3周末時(shí)出現(xiàn)較大病灶，大鼠模型建立成功。用生理鹽水及辛伐他?。? mg／kg·d）灌胃 2周后，生理鹽水組大鼠根尖骨吸收陰影體積未見明顯改變，辛伐他汀組大鼠根尖骨吸收陰影體積減小，有愈合趨勢（圖1）。

圖1 大鼠根尖周炎模型病灶Micro-CT掃描影像分析Fig 1 Analysis of Micro-CT images of rat periapical periodontitis focus

2.2 實(shí)驗(yàn)性根尖周炎骨病灶HE染色

開髓術(shù)后3周末時(shí)，與對照組相比，病灶組織面積明顯增大。用生理鹽水及辛伐他汀灌胃2周后，生理鹽水組大鼠根尖病灶面積明顯大于辛伐他汀組大鼠根尖病灶面積（圖2）。

圖2 實(shí)驗(yàn)性根尖周炎骨病灶HE染色 （×40）Fig 2 HE staining of experimental periapical periodontitis focus（×40）

2.3 辛伐他汀對HMSCs堿性磷酸酶活性影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，辛伐他汀會(huì)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，且與辛伐他汀的劑量呈正比關(guān)系。表明辛伐他汀可促進(jìn)HMSC向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化（圖3）。

圖3 辛伐他汀對HMSC細(xì)胞堿性磷酸酶活性影響Fig 3 The effect of simvastatin on ALP activity of HMSCs

2.4 辛伐他汀對 HMSCs Wnt、β-catenin及 Cyr61蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，辛伐他汀會(huì)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 Wnt、β-catenin及Cyr61蛋白的表達(dá)，且與辛伐他汀的劑量呈正比關(guān)系。表明辛伐他汀可激活HMSC細(xì)胞中的Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而通過Cyr61的表達(dá)調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化，促進(jìn)炎癥病灶愈合（圖4）。

圖4 辛伐他汀對HMSCs Wnt、β-catenin及Cyr61蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effect of simvastatin on Wnt，β-catenin and Cyr61 expression in HMSCs

3 討 論

他汀類降脂藥促進(jìn)骨形成的作用越來越受到人們關(guān)注，有研究報(bào)道，辛伐他汀可促進(jìn)修復(fù)牙本質(zhì)［8］。本實(shí)驗(yàn)中，Micro-CT掃描和HE染色結(jié)果表明，辛伐他汀可促進(jìn)根尖周炎的愈合。

Cyr61作為一種分泌型基質(zhì)蛋白，廣泛參與到調(diào)控細(xì)胞增殖、黏附、遷移、分化、損傷修復(fù)和胚胎發(fā)育等多種功能當(dāng)中去。有研究證實(shí)，Cyr61可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的遷移作用［9］。本實(shí)驗(yàn)中，通過Western blot證實(shí)了10－7mol／L劑量的辛伐他汀就可以促進(jìn)Cyr61的表達(dá)，且這種影響是劑量依賴的，藥物濃度越大，上述改變越明顯。

以往研究表明，CCN家族的部分成員如CCN4／WISP1和CCN5／WISP2已經(jīng)被證明是由Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)的［10］。成骨細(xì)胞對根尖骨質(zhì)修復(fù)具有重要意義，如何使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化對牙根尖周炎的治療有著重要的研究價(jià)值［11］。有研究表明，在HMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中經(jīng)典的Wnt／β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮積極作用［12－13］。

Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典和非經(jīng)典兩種，研究表明在骨形成的過程中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路起到重要作用，其通過刺激成骨前體細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其成骨分化，抑制成骨細(xì)胞凋亡等機(jī)制維持骨量平衡［14］。當(dāng)Wnt通路活化時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞表面的特異性受體卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)z）結(jié)合，F(xiàn)z則進(jìn)一步激活胞質(zhì)蓬亂蛋白（dishevelled，Dvl），胞漿內(nèi)的Dvl被高度磷酸化，被激活的Dvl蛋白可以抑制GSK－3β的活性，使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致非磷酸化的β-catenin無法降解而在細(xì)胞內(nèi)堆積。最終胞質(zhì)內(nèi)β-catenin含量積聚并移至核內(nèi)，與T細(xì)胞因子相互作用［15］，TCF被激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［16］。

本研究表明辛伐他汀干預(yù)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在增加Cyr61表達(dá)同時(shí)，也促進(jìn)其經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活，并且總體呈現(xiàn)濃度依賴趨勢，即辛伐他汀藥物濃度越大，促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)的能力越明顯。這提示辛伐他汀可能是通過激活Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而提高Cyr61蛋白的表達(dá)水平，最終刺激了HMSCs向成骨細(xì)胞的分化。即Cyr61作為Wnt／β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶基因參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程。

總之，一定劑量應(yīng)用辛伐他汀可通過激活促進(jìn)成骨細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路，提高Cyr61表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，這可能是辛伐他汀促進(jìn)根尖炎骨質(zhì)修復(fù)的分子機(jī)制，也是本研究輔助治療根尖炎的新靶點(diǎn)。