劉利鵬 安維康 鄭亞飛 張薇 王青 馬楚凡

鈦因良好的生物相容性及機(jī)械性能而廣泛應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域，但隨著鈦種植體在口腔內(nèi)長期行使功能，種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎成為臨床上最常見的生物學(xué)并發(fā)癥。除致病菌因素外，這與種植體周圍缺乏良好的軟組織封閉密切相關(guān)［1］。

半橋粒是最重要的生物封閉結(jié)構(gòu)之一，形成上皮細(xì)胞與牙齒間的有效連接［2］。與天然牙－牙齦結(jié)合界面不同的是，種植體周圍僅在上皮根方有半橋粒的分布，因此無法形成類似天然牙的生物學(xué)封閉［3］。研究發(fā)現(xiàn)，層粘連蛋白5（laminin5，LN5）在半橋粒的形成和完整性的維持中起著重要的作用［4］。但直接在鈦表面吸附LN5存在負(fù)載量大、代謝快的問題，很難達(dá)到理想的效果。聚消旋乳酸［poly（D，L-lactide），PDLLA］是一種惰性、無定形的聚乳酸立體聚合物，具有良好的生物相容性及生物降解性能，常用作植入物的穩(wěn)定涂層及藥物輸送載體，其本身對層粘連蛋白還有很好的吸附作用［5－6］。

因此，本研究擬通過層層組裝－物理吸附的方式在純鈦基底表面構(gòu)建PDLLA-LN5復(fù)合涂層，進(jìn)行涂層觀察與分析，并觀察其對角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步用于提高種植體周圍軟組織封閉做初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

純鈦片（直徑15 mm，寶雞弘森鈦制品有限公司）；碳化硅砂紙400～3000目（勇士，德國）；PDLLA（Sigma，美國）；LN5（BioLamina，瑞典）；CCK-8試劑盒（同仁，日本）；LAMA3酶聯(lián)免疫試劑盒（CUSABIO，武漢華美生物工程有限公司）；鬼筆環(huán)肽（Cytoskeleton，美國）。

場發(fā)射掃面電子顯微鏡（Hitachi，日本）；力學(xué)表面張力儀（KrussK100，德國）；共聚焦激光掃描顯微鏡（尼康 A1 plus，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鈦表面PDLLA-LN5涂層的制備及表征 鈦片經(jīng)碳化硅砂紙序列打磨拋光，丙酮、無水乙醇及雙蒸水超聲清洗15 min，75%酒精浸泡下紫外消毒過夜，得到表面光滑的無菌鈦試樣（P組）；PDLLA以10 mg／mL的濃度溶解于有機(jī)溶劑乙酸乙酯，在光滑的鈦試樣表面均勻滴加，待乙酸乙酯完全揮發(fā)后得到表面覆蓋PDLLA的鈦試樣（PDLLA組）；在涂覆PDLLA的鈦試樣表面均勻滴加LN5溶液，4℃靜置24 h后于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，再次滴加PDLLA溶液及LN5溶液，重復(fù)3次，得到純鈦表面PDLLA-LN5復(fù)合涂層（PDLLA／LN5組）。試樣干燥后，于掃描電子顯微鏡下觀察表面形貌，通過力學(xué)表面張力儀測定不同試樣表面的靜態(tài)水接觸角。

1.2.2 PDLLA-LN5復(fù)合涂層LN5緩釋曲線測定將PDLLA-LN5復(fù)合涂層置于5mL PBS，并放于37℃孵箱中，在不同時(shí)間點(diǎn)（6 h、1、3、5、7、9、11、14、21、28 d）取樣500μL，同時(shí)補(bǔ)加等體積的PBS溶液。用ELISA試劑盒測定所取樣品中LN5的濃度，計(jì)算累計(jì)釋放量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值，并根據(jù)結(jié)果繪制曲線。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%青／鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液，細(xì)胞層生長至70%～80%時(shí)傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將3組鈦試樣在超凈工作臺(tái)內(nèi)放入24孔培養(yǎng)板中（每組3個(gè)試件），HaCaT細(xì)胞（2×104個(gè)／孔）接種在各組鈦試樣表面，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、12、24 h后終止培養(yǎng)，PBS漂洗3次，2.5%戊二醛 4℃固定過夜。PBS漂洗后，依次用20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%乙醇脫水 5 min，六甲基二硅胺烷浸泡30 min后通風(fēng)櫥干燥，噴金后掃描電子顯微電鏡（SEM）下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種方法參照 1.2.4，接種1、3、5、7 d后，于同一時(shí)間點(diǎn)吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS漂洗 3次，每孔加入 50μL CCK-8和 500μL DMEM培養(yǎng)基，孵育2 h，每孔吸出100μl加入96孔板中，酶標(biāo)儀測量（450 nm）吸光度A值。

1.2.6 細(xì)胞黏附 細(xì)胞接種方法參照 1.2.4，于 0.5、2、6、24 h后終止培養(yǎng)，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30min，DAPI染色后共聚焦激光掃描顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞遷移 細(xì)胞接種方法參照 1.2.4，接種密度為5×104個(gè)／孔。待細(xì)胞貼壁長滿后，吸棄孔板內(nèi)培養(yǎng)基，沿著孔的中軸豎直劃線，PBS漂洗3次，每孔加入無血清培養(yǎng)基1 mL，將此時(shí)間點(diǎn)定義為0 h。于12、24 h后終止培養(yǎng)，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定過夜，鬼筆環(huán)肽和DAPI染色后共聚焦顯微鏡下拍照，使用ImageJ軟件測量0、12和24 h劃痕面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPadPrism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey的多重比較檢驗(yàn)評估實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鈦試樣表面微觀形貌觀察和接觸角

掃描電鏡可見，P組呈現(xiàn)出較為光滑的表面形態(tài)，存在少量打磨拋光劃痕；PDLLA組表面非常光滑；PDLLA／LN5表面可見均勻球狀顆粒，少部分形成聚集體（圖 1）。

圖1 各組樣品表面形貌和水接觸角Fig 1 The topography and contact angle of various specimens

P組、PDLLA組和PDLLA／LN5組材料表面的接觸角分別為（29.9±4.04）°、（72.72±4.93）°和（45.2±3.23）°。

2.3 LN5的釋放曲線

由釋放曲線（圖2）可見，在0～1 d LN5突釋，其后速率降低（1～5 d），接著速率再次減緩（5～11 d），之后在11～14 d會(huì)再次突釋，并在14d之后，進(jìn)入平衡期。

圖2 LN5的釋放曲線Fig 2 Cumulative release（ng）of LN5

2.4 細(xì)胞形態(tài)

與P組相比，PDLLA組細(xì)胞絲狀偽足短且少，PDLLA／LN5組細(xì)胞鋪展面積大，絲狀偽足長且豐富（圖 3）。

圖 3 接種6、12、24 h后掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài) （SEM，×5 000）Fig 3 Morphology of HaCaT cells cultured on various sample surfaces 6，12 and 24 h after seeding （SEM，×5 000）

2.5 細(xì)胞增殖

角質(zhì)形成細(xì)胞在鈦試樣表面的增殖隨時(shí)間均呈上升趨勢，除第1天外，3組增殖情況由高到低排序?yàn)椋篜DLLA／LN5組＞P組＞PDLLA組，在3 d和5 d，PDLLA／LN5組高于另外兩組（P＜0.01）（圖 4）。

圖4 HaCaT的細(xì)胞增殖情況Fig 4 Proliferation of HaCaT cells

2.6 細(xì)胞黏附

如圖5所示。在不同樣品表面，角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附數(shù)量隨著時(shí)間增多。相同時(shí)間內(nèi)，PDLLA／LN5組＞P組＞PDLLA組。其中，2、6、24 h時(shí)，PDLLA／LN5組表面細(xì)胞粘附數(shù)量明顯高于PDLLA組（P＜0.05）；24 h時(shí)，PDLLA／LN5組表面細(xì)胞粘附數(shù)量明顯高于P組（P＜0.05）

圖5 細(xì)胞粘附熒光染色圖像（×100）和定量計(jì)數(shù)Fig 5 Representative nuclei staining（×100）and quantitative counting of adherent cells

2.7 細(xì)胞遷移

如圖6所示。劃痕愈合率＝（0 h劃痕面積－12或24 h劃痕面積）／0 h劃痕面積×100%。在12 h和24 h后，P組和PDLLA／LN5組劃痕愈合率沒有明顯差異，12 h約為17%，24 h約為33%。兩組的劃痕愈合率均明顯高于 PDLLA組（P＜0.01）。

圖6 角質(zhì)形成細(xì)胞體外劃痕愈合性能評估Fig 6 Evaluation of in vitro wound healing performance

3 討 論

目前臨床上常用的光滑基臺(tái)難以形成并維持生物學(xué)封閉［7］，主要原因是種植體牙齦界面中上2／3內(nèi)層基底板不完整以及半橋粒缺乏，無法有效的阻擋細(xì)菌的侵入，因而更容易導(dǎo)致種植體黏膜炎和周圍炎的發(fā)生［8］。Astuta等［3］通過對種植體牙齦界面的超微結(jié)構(gòu)研究后認(rèn)為LN5分泌不足是種植體牙齦界面中上2／3內(nèi)層基底板不完整和半橋粒缺乏的重要原因。LN5是內(nèi)層基底板的主要組成部分，通過整合素α6β4介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、黏附與遷移［9］；有學(xué)者將LN5涂覆在鈦或氧化鋯表面來改善種植體－軟組織的相互作用，發(fā)現(xiàn)改善了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與黏附，并促進(jìn)了半橋粒的形成［10－11］。種植體植入后，LN5易被纖溶酶降解，且擴(kuò)散快［12］，為了LN5的穩(wěn)定和長期釋放，需要一個(gè)控制系統(tǒng)在種植體－軟組織傷口愈合過程中持續(xù)地釋放LN5。PDLLA具有良好的生物學(xué)相容性及生物降解性能［13］，體外研究發(fā)現(xiàn)其有很低的免疫及過敏反應(yīng)，并且可以通過在種植體和宿主組織之間建立屏障來降低鈦的免疫原性［6］，因此PDLLA常應(yīng)用于藥物輸送系統(tǒng)及種植體表面輸送生長因子［14］；此外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PDLLA與經(jīng)皮組織的表面化學(xué)性質(zhì)接近，對層粘連蛋白有高的選擇吸附性［5］。

本研究通過層層組裝－物理吸附的方式，在光滑鈦表面成功構(gòu)建了PDLLA-LN5復(fù)合緩釋涂層。通過ELISA測得PDLLA-LN5復(fù)合涂層中LN5的緩釋曲線，PDLLA-LN5復(fù)合涂層釋放LN5主要通過三種現(xiàn)象［15］，一是吸附在PDLLA表面LN5向外界LN5低濃度溶液的擴(kuò)散，該現(xiàn)象與本實(shí)驗(yàn)LN5釋放曲線中0～1 d的突釋階段對應(yīng)；二是吸附在PDLLA表面LN5的溶解，該現(xiàn)象與1～5 d的階段對應(yīng)；三是由于PDLLA的降解導(dǎo)致下層LN5的釋放，該階段與5～28 d的階段對應(yīng)，其中11～14 d再次發(fā)生突釋是因?yàn)殡S著PDLLA的降解，底層加載的LN5向溶液中擴(kuò)散。

PDLLA-LN5復(fù)合涂層對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。角質(zhì)形成細(xì)胞在增殖過程中經(jīng)歷擴(kuò)張和平衡兩種模式［16］。本實(shí)驗(yàn)中，PDLLA-LN5復(fù)合涂層上的細(xì)胞在1～5 d時(shí)處于擴(kuò)張模式，并在培養(yǎng)的5～7 d之間的某個(gè)時(shí)間經(jīng)歷轉(zhuǎn)變到平衡模式，即相較于另外兩組，PDLLA-LN5復(fù)合涂層表面的細(xì)胞增殖較快，更早地達(dá)到細(xì)胞的臨界匯合狀態(tài)。

在種植體植入后，角質(zhì)形成細(xì)胞從基底膜分離遷移至傷口處參與上皮的再生過程［9］，因此細(xì)胞在材料表面的黏附和遷移能力是評價(jià)生物功能性材料的重要指標(biāo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，PDLLA組表面細(xì)胞黏附數(shù)量較少，細(xì)胞偽足短且少，這可能是由于PDLLA表面缺乏親水基團(tuán)及活性基團(tuán)，親水性差，細(xì)胞親和力較低，不利于細(xì)胞的黏附［17］。LN5是重要的細(xì)胞黏附分子，通過整合素α6β4與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，參與半橋粒的形成從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附［18］。LN5具有親水和疏水兩個(gè)位點(diǎn)［10］，加載在 PDLLA表面后，親水位點(diǎn)暴露，親水性增高，材料的接觸角增大。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)加載了LN5的復(fù)合涂層表面角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附數(shù)量更多，細(xì)胞鋪展面積更大，絲狀偽足長且密，說明PDLLA-LN5復(fù)合涂層對角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附具有促進(jìn)作用。

細(xì)胞遷移為細(xì)胞頭部偽足延伸、尾部收縮的交替過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于P組和PDLLA組，PDLLA／LN5組的絲狀偽足多且密，處于遷移活躍狀態(tài)。PDLLA-LN5組角質(zhì)形成細(xì)胞遷移能力和P組沒有顯著性差異，這可能是因?yàn)榧?xì)胞遷移早期半橋粒的解聚激活不完全［19］。與PDLLA組相比，PDLLA-LN5復(fù)合涂層顯著地促進(jìn)了細(xì)胞的遷移。本研究猜測PDLLA-LN5復(fù)合涂層表面釋放LN5能促進(jìn)整合素α3β1、α6β4的表達(dá)和受體識(shí)別，進(jìn)而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移［20－21］。

綜上所述，本研究在純鈦表面成功構(gòu)建了PDLLA-LN5復(fù)合緩釋涂層，LN5均勻吸附在PDLLA表面并有著至少28 d的緩釋效果，對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、黏附和遷移產(chǎn)生了有利影響，對于促進(jìn)牙科種植體周圍軟組織封閉具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。