戴太強(qiáng) 王樂(lè) 高曄 呂前欣 靳丹 鮑涵 劉富偉 孔亮

顳下頜關(guān)節(jié)軟骨在承受咀嚼力、潤(rùn)滑、關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)等方面具有重要作用，其功能發(fā)揮很大程度依賴(lài)于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)［1］。顳下頜關(guān)節(jié)髁突表面軟骨為繼發(fā)性軟骨，發(fā)育過(guò)程易受內(nèi)外因素影響，造成關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)異常，從而影響關(guān)節(jié)功能［2］。因此，研究關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌調(diào)控因素，對(duì)于闡明軟骨發(fā)育性疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1（casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1）是具有廣泛作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要調(diào)控作用［3］。然而，CKIP-1是否對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌具有調(diào)控作用尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)CKIP-1－／－小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)減少，在本研究中以軟骨祖細(xì)胞ATDC5為研究對(duì)象，借助細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)手段，探究CKIP-1調(diào)控ATDC5細(xì)胞外基質(zhì)分泌的生物學(xué)功能及可能的分子機(jī)制，以期為CKIP-1對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的調(diào)控作用研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選育6對(duì)8周齡同窩雄性CKIP-1敲除的純合（CKIP-1－／－）與野生型（WT）C57BL／6小鼠（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院構(gòu)建），用于觀察CKIP-1對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的影響。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠軟骨祖細(xì)胞ATDC5購(gòu)自豐暉生物有限公司（CL0036），含10%胎牛血清（杭州四季青）及1%青鏈霉素的DMEM／F-12培養(yǎng)基（HyClone，美國(guó)），于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，1∶3傳代。

1.2 方法

1.2.1 顳下頜關(guān)節(jié)組織切片 制備分離獲取WT與CKIP-1－／－小鼠顳下頜關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋切片，備用。

1.2.2 番紅O染色 切片常規(guī)脫蠟、水化。0.02%固綠浸染5 min，弱酸溶液快速洗滌10 s，0.1%番紅O浸染5 min，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。Image J分析番紅O染色面積。

1.2.3 CKIP-1低表達(dá) ATDC5細(xì)胞株的建立 將ATDC5以1×104個(gè)／孔接種至24孔板，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別加入2×105TU LV＿siCKIP-1（siRNA 有 義 鏈 序 列： 5′-CCTGAGTGACTATGAGAAGTT-3′）與 LV＿si NC（siRNA有義鏈序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3′）慢病毒（上海吉?jiǎng)P生物公司）感染細(xì)胞。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后觀察細(xì)胞感染效率；含8μg／mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選1周后，利用單細(xì)胞克隆法獲得CKIP-1低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.2.4 qPCR檢測(cè) 提取細(xì)胞總RNA，10μL體系反轉(zhuǎn)錄，20μL體系（10μL TB Green，10 pmol特異性引物）PCR反應(yīng)（試劑均來(lái)自Takara，日本）。反應(yīng)條件：95℃變性15 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。GAPDH為內(nèi)參基因，按2－ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。取15μg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，恒壓100 V轉(zhuǎn)膜60min，5%脫脂牛奶封閉，4℃孵育anti-CKIP-1抗體（1∶300，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），anti-GAPDH抗體（1∶1000，CST，美國(guó)）過(guò)夜。次日 1×TBS-T洗膜，室溫孵育二抗（1∶10000，CST）1 h后洗膜，利用 Chemi化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6 ATDC5成軟骨誘導(dǎo) 按 2×105個(gè)／孔接種對(duì)照及CKIP-1敲低ATDC5至六孔板行成軟骨誘導(dǎo)，每3 d換液。成軟骨誘導(dǎo)14 d后，取細(xì)胞膜片制備切片，行HE、阿利新藍(lán)及甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況，染色步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 Tizol法提取CKIP-1穩(wěn)定低表達(dá)ATDC5及對(duì)照組細(xì)胞總RNA（各3個(gè)重復(fù)樣本），質(zhì)控檢測(cè)后，建立文庫(kù)，使用illuminaNovaseqTM6000（杭州聯(lián)川生物）按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序模式為PE150。

1.2.8 測(cè)序結(jié)果 分析將原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量和重復(fù)序列，使用 HISAT2（https：／／daehwankimlab.github.io／hisat2）將得到的數(shù)據(jù)比對(duì)到小鼠基因組上，利用StringTie（http：／／ccb.jhu.edu／software／stringtie）對(duì)轉(zhuǎn)錄本初組裝，將所有樣本的初組裝結(jié)果合并，用gffcompare （http：／／ccb.jhu.edu／software／stringtie／gffcompare.shtml）檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本與參考注釋的比較得到最終組裝注釋結(jié)果。使用ballgown包提供文件輸入進(jìn)行FPKM定量（FPKM ＝total＿exon＿fragments／mapped＿reads（millions）×exon＿length（kB）），同時(shí)對(duì)樣本之間進(jìn)行顯著差異分析，將差異倍數(shù)FC＞2倍或FC＜0.5倍且P＜0.05的基因定義為差異基因，并對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CKIP-1敲除對(duì)小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的影響

番紅O染色顯示，與 WT小鼠相比，CKIP-1－／－小鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨異常（圖 1A），成熟肥大軟骨細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)目顯著減少（圖 1B，P＜0.05），且軟骨細(xì)胞外基質(zhì)含量顯著減少（圖 1C，P＜0.01），提示CKIP-1可能參與調(diào)控軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與軟骨細(xì)胞分化。

圖1 CKIP-1對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)影響分析 （×200）Fig 1 Evaluation of the effects of CKIP-1 on temporomandibular joint cartilage ECM （×200）

2.2 CKIP-1敲低ATDC5細(xì)胞株的建立

為探明CKIP-1在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌或軟骨形成方面的生物學(xué)功能，利用小干擾RNA慢病毒構(gòu)建CKIP-1敲低的ATDC5細(xì)胞系（載體信息如圖 2A所示）。結(jié)果顯示，慢病毒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖2B）。與對(duì)照組相比，CKIP-1敲低ATDC5細(xì)胞株中CKIP-1的mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.001），CKIP-1的沉默效率可高達(dá)80%以上（圖2C），表明CKIP-1穩(wěn)定低表達(dá)的ATDC5軟骨細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖2 CKIP-1敲低ATDC5細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定Fig 2 Construction and identification of ATDC5 cell strain with CKIP-1 knockdown

2.3 CKIP-1對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響

利用14 d成軟骨誘導(dǎo)模擬成熟軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌狀態(tài)。HE染色顯示兩組膜片均為復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，CKIP-1敲低組膜片組織量較對(duì)照組減少，且其組織結(jié)構(gòu)相對(duì)紊亂、松散，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞散落于基質(zhì)外（紅箭頭所示）。阿利新藍(lán)染色示CKIP-1敲低組與對(duì)照組未見(jiàn)顯著差異，甲苯胺藍(lán)染色中，CKIP-1敲低組細(xì)胞外基質(zhì)含量較對(duì)照組顯著減少（圖3）。

圖3 CKIP-1敲低后對(duì)ATDC5成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響Fig 3 Evaluation of extracellular matrix secretion of ATDC5 after CKIP-1 knockdown followed by chondrogenic induction

2.4 CKIP-1敲低ATDC5細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析及驗(yàn)證

提取CKIP-1敲低及對(duì)照ATDC5細(xì)胞總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組RNA-seq測(cè)序分析（圖4A），發(fā)現(xiàn)CKIP-1敲低后對(duì)679個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響（差異倍數(shù)＞2或＜0.5），其中378個(gè)基因顯著上調(diào)，301個(gè)基因下調(diào)（圖4B，4C）。對(duì)679個(gè)差異顯著基因進(jìn)行“生物學(xué)過(guò)程”GO富集，65%以上的顯著差異基因與細(xì)胞分化功能有關(guān)，50%以上的顯著差異基因與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)（圖4D），表明CKIP-1可能在調(diào)控軟骨祖細(xì)胞分化及信號(hào)傳導(dǎo)方面具有重要的生物學(xué)功能。隨后通過(guò)“軟骨及軟骨細(xì)胞的所有條目”對(duì)顯著差異基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示有5個(gè)基因與軟骨發(fā)育相關(guān)（Sox6、Nog、Edn1、Cola1、Msx1），4個(gè)基因與軟骨細(xì)胞分化相關(guān)（Mef2c、Bmp4、Tgfbi、Hmga2），同時(shí)也與軟骨細(xì)胞增殖及軟骨形態(tài)形成具有顯著的相關(guān)性（圖4E）。

KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，CKIP-1敲低后對(duì)軟骨具有重要調(diào)控作用的Hedgehog、Wnt／β-catenin以及PI3K／Akt信號(hào)通路都具有明顯的影響（圖4F），其中對(duì)Hedgehog信號(hào)通路影響最為顯著。qPCR驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序一致，CKIP-1敲低后軟骨相關(guān)基因Col2a、Sox6、Edn1及 Hmga2的表達(dá)顯著降低，Cola1、Tgfbi的表達(dá)顯著升高（圖 4G）；Hedgehog信號(hào)通路的下游的關(guān)鍵基因Gli1與Bcl2的表達(dá)顯著降低（圖4H），表明CKIP-1敲低后Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制。

圖 4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及結(jié)果驗(yàn)證 （*P＜0.05，**P＜0.01）Fig 4 Results of transcriptome sequencing analysis and verification by qPCR（*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討 論

CKIP-1作為負(fù)調(diào)控因子影響骨形成而受到廣泛的關(guān)注［3－5］。然而，其在軟骨組織中是否具有調(diào)控作用尚未可知。本研究中發(fā)現(xiàn)CKIP-1－／－小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)流失，且CKIP-1敲低后軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)合成能力顯著減弱。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生物信息學(xué)篩選驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CKIP-1對(duì)軟骨發(fā)育及分化相關(guān)的Hedgehog等經(jīng)典信號(hào)通路具有顯著的影響，這初步揭示了CKIP-1對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的影響，為進(jìn)一步探明CKIP-1在調(diào)控顳下頜關(guān)節(jié)形成方面的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Hedgehog、Wnt／β-catenin以及 PI3K／Akt信號(hào)通路對(duì)關(guān)節(jié)軟骨形成具有重要調(diào)控作用。其中Hedgehog信號(hào)通路對(duì)出生后顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的髁突表層／祖細(xì)胞層發(fā)育和功能至關(guān)重要，其在幼年小鼠中的敲除會(huì)導(dǎo)致髁突的退行性改變，表現(xiàn)為髁突軟骨細(xì)胞異常成熟和軟骨下骨形成［6－7］。而Wnt信號(hào)在調(diào)控軟骨細(xì)胞肥大和軟骨內(nèi)骨化方面具有重要作用［8－9］。有研究表明增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，如軟骨厚度及軟骨蛋白聚糖積累增強(qiáng)，以防止軟骨降解［10］。PI3K在軟骨生成和軟骨細(xì)胞分化中起著重要的作用［11－13］。研究表明PI3K-Akt信號(hào)的激活抑制了軟骨細(xì)胞從增殖到肥大分化的過(guò)渡，但促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的終末分化［14］。本研究結(jié)果證實(shí)，CKIP-1敲低后會(huì)造成Hedgehog、Wnt／β-catenin以及PI3K／Akt信號(hào)通路不同程度的抑制，從而影響關(guān)節(jié)軟骨形成及細(xì)胞分化成熟，最終造成關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的減少。其中，以對(duì)Hedgehog信號(hào)通路的影響最為顯著。以上結(jié)果也表明，CKIP-1可能是顳下頜關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)調(diào)控信號(hào)通路中的重要作用靶點(diǎn)，但其明確的作用機(jī)制還需要后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，CKIP-1在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨調(diào)控中具有重要作用，敲低或敲除CKIP-1可造成顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的減少，其作用可能是影響軟骨細(xì)胞的成熟和細(xì)胞外基質(zhì)分泌功能，并通過(guò)與軟骨調(diào)控具有重要關(guān)系的Hedgehog等信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，維持或促進(jìn)CKIP-1的表達(dá)可能對(duì)軟骨基質(zhì)的形成和發(fā)育具有促進(jìn)作用，本研究為CKIP-1對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的調(diào)控作用提供了理論支持，并為顳下頜關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育異常造成的基質(zhì)減少提供了可能的治療靶點(diǎn)。