王沛雅，方彥昊，郭 琪，張 軍，李 鑫，楊 暉，王治業(yè)，楊 濤

甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“特色微生物與植物資源創(chuàng)新”甘肅省國際科技合作基地，蘭州 730000

沙冬青(Ammopiptantusmongolicus(Maxim.ex kon)Cheng f)又名蒙古沙冬青，屬于豆科蝶形花亞科沙冬青屬，是我國荒漠地區(qū)唯一的超旱生常綠闊葉灌木樹種，被國家列入第1 批珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[1,2]。沙冬青是傳統(tǒng)的民族藥材(蒙藥)，名“孟和哈日嘎訥”，其枝葉可入藥，具有祛風(fēng)濕、活血、散瘀、止痛的功效，外用還能治療凍瘡、尤用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病效果顯著[3-5]。其體內(nèi)含有豐富的生物活性物質(zhì)，有生物堿類、黃酮及異黃酮類、有機(jī)酸、二苯乙烯類、甾醇及單萜類等，具有降糖、抗腫瘤、抗病毒、殺菌、抗氧化、殺蟲等作用功效[6-11]。

毛狀根(hairy root)大規(guī)模繁殖培養(yǎng)能獲得大量理想的藥用物質(zhì)，迄今為止，通過毛狀根可以培養(yǎng)生產(chǎn)出的次生代謝產(chǎn)物已涵蓋生物堿類、苷類、黃酮類、醌類、多糖類等多種物質(zhì)[12-15]。Liu等[16]通過建立人參毛狀根培養(yǎng)體系，其毛狀根中的總皂苷含量可達(dá)2.468%，接近人參原藥材含量的2倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402和R1601感染甘草外植體產(chǎn)生毛狀根，其中5種黃酮類化合物的總量比愈傷組織中高1.5倍，甘草查耳酮含量是愈傷組織的15.5倍[17]，Yang等[18]誘導(dǎo)培養(yǎng)杜仲毛狀根，其次生代謝產(chǎn)物桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于自然根及皮，最高可達(dá)30.105 mg/g。目前，國內(nèi)外學(xué)者對蒙古沙冬青的研究主要集中于其地上藥用部分及種子中化學(xué)成分及藥理活性，尚未見對其毛狀根組織代謝積累情況的報(bào)道。本研究選取長勢較好的蒙古沙冬青毛狀根根系與其自然根對比，采用UHPLC-Q-TOF-MS實(shí)驗(yàn)技術(shù)對樣本進(jìn)行了進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，初步了解其毛狀根組織差異代謝產(chǎn)物積累及代謝通路情況，為蒙古沙冬青毛狀根代謝產(chǎn)物積累及途徑解析提供理論依據(jù)，為后期借助毛狀根途徑生產(chǎn)蒙古沙冬青活性代謝成分提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青材料來自中科院鄂爾多斯實(shí)驗(yàn)站(內(nèi)蒙古杭錦旗呼和都呼木，40°12′9″～11″N/107°22′25″～32″E)。

蒙古沙冬青毛狀根由本課題組利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株侵染沙冬青子葉誘導(dǎo)獲得。毛狀根組織于無激素的固體1/2MS培養(yǎng)基中，25 ℃，黑暗條件下保存在甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，定期轉(zhuǎn)接并PCR驗(yàn)證。

1.2 儀器

超高效液相Agilent 1290(美國安捷倫公司)；高分辨質(zhì)譜Triple TOF 6600(AB Sciex，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Agilent 1260高效液相色譜(美國安捷倫公司)，Agilent-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司)；Thermo GenPure Pro型超純水器(美國賽默飛公司)。

1.3 方法

將蒙古沙冬青毛狀根組織與幼根樣品廣泛非靶向代謝組檢測和數(shù)據(jù)分析委托百邁客生物科技有限公司采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)依賴采集方式對樣本進(jìn)行分析，獲得一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用XCMS對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取和代謝物鑒定。

供試品溶液制備：樣品先真空冷凍干燥，稱取10 mg樣品，加入500 μL提取液(V甲醇∶V乙腈∶V水=2∶2∶1，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物)，渦旋混勻30 s，加入鋼珠，35 Hz研磨處理4 min，冰水浴超聲5 min。重復(fù)研磨，超聲處理2次，-40 ℃靜置1 h，將樣品4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清250 μL于EP管中，真空干燥。加入200 μL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈復(fù)溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min，將樣品在4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取75 μL上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)，用于UPLC-MS分析。所有樣品另取10 μL混合成QC樣品上機(jī)分析。

色譜質(zhì)譜采集條件：使用Agilent 1290(Agilent Technologies)超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。采用梯度洗脫：0～0.5 min，體積分?jǐn)?shù)95%B；0.5～7 min，體積分?jǐn)?shù)95%B→65%B；7～8 min，體積分?jǐn)?shù)65%B→40%B；8～9 min，體積分?jǐn)?shù)40%B；9～9.1 min，體積分?jǐn)?shù)40%B→95%B；9.1～12 min，體積分?jǐn)?shù)95%B。流動相流速：0.5 mL/min，柱溫：25 ℃，樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：正離子1 μL；負(fù)離子1 μL。

使用Triple TOF 6600高分辨質(zhì)譜，通過IDA(information-dependent acquisition)模式進(jìn)行高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在IDA這種模式下，數(shù)據(jù)采集軟件(Analyst TF 1.7，AB Sciex)依據(jù)一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和預(yù)先設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，自動選擇離子并采集其二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。每個(gè)循環(huán)選取12個(gè)強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，碰撞誘導(dǎo)解離的能量為30 eV，循環(huán)時(shí)間為0.56 s。離子源參數(shù)如下，GS1：60 psi，GS2：30 psi，CUR：35 psi，TEM：600 ℃，DP：60 V，ISVF：5 000 V(Pos)/-4 000(Neg)。

樣本質(zhì)控分析：質(zhì)控樣本(QC)由兩組樣品提取物混合制備而成，共3次重復(fù)，用來分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過比較離子碎片模式、保留時(shí)間和m/z值，并通過百邁客生物科技有限公司的自建數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)、公共數(shù)據(jù)庫代謝物信息和二級譜信息對代謝物進(jìn)行鑒定。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)對代謝物進(jìn)行定量，獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜并對其進(jìn)行峰面積積分，最后不同樣本的相同代謝物中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。采用R軟件(https://www.r-project.org/)對鑒定的代謝產(chǎn)物進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析(PCA)，從總體上得到各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。利用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后進(jìn)行中心化處理，獲得導(dǎo)致兩組之間顯著差異的相關(guān)代謝物信息。根據(jù)OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影(variable importance in project，VIP)評分，將VIP≥1，差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)值≥2篩選組間差異代謝物，并用t檢驗(yàn)(雙尾平均值)評估代謝物含量差異的顯著性(P<0.05)，同時(shí)將得到的相應(yīng)差異代謝物通過代謝通路數(shù)據(jù)KEGG Pathways(https://www.genome.jp/keg)進(jìn)行解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古沙冬青毛狀根樣本UHPLC-Q-TOF-MS的總離子流圖

通過UPLC-Q-TOF-MS中LC-MS技術(shù)對蒙古沙冬青毛狀根和自然根中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示正、負(fù)離子模式下均有較好的響應(yīng)，所有樣品的儀器分析均信號強(qiáng)、峰容量大且保留時(shí)間重現(xiàn)性好。正、負(fù)離子模式下的得到典型總離子流色譜圖(total ions chromatograph，TIC)圖譜如圖1所示，蒙古沙冬青毛狀根檢測到的代謝產(chǎn)物與其自然根系相比具均有明顯差異。毛狀根組織和自然根樣本在正離子模式下得到3 982種代謝物，在負(fù)離子模式下得到4 209種代謝物。通過數(shù)據(jù)比對分析，初步推斷蒙古沙冬青毛狀根組織可積累類黃酮、生物堿、酚酸、氨基酸、有機(jī)酸、脂質(zhì)等豐富的代謝產(chǎn)物，如：芒柄花苷、降紫香苷、芒柄花素、黃豆黃素、黃豆黃素苷、苜蓿毒素、高麗槐素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、異補(bǔ)骨脂甲素等類黃酮化合物，葫蘆巴堿、氧化苦參堿、毒芹堿、白羽扇豆堿等生物堿類化合物，還有龍膽酸、亞油酸、苜蓿酚、白藜蘆醇、temazepam等眾多藥效功能化合物。

圖1 蒙古沙冬青毛狀根與自然根樣本的HPLC-Q-TOF-MS總離子流圖(TIC)

2.2 主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結(jié)果

PCA通過建立低維平面或空間，分析和概覽整個(gè)數(shù)據(jù)集，揭示數(shù)據(jù)集中觀測變量的分組、趨勢及離群值，從而發(fā)現(xiàn)各變量間的相似性或差異性。圖2中可以看出，正離子模式下主成分PC1與PC2的占比分別達(dá)到了45.66%和22.41%，積累貢獻(xiàn)率達(dá)到了68.07%；負(fù)離子模式下二者的占比分別達(dá)到了41.42%和12.75%，積累貢獻(xiàn)率達(dá)到了54.17%。蒙古沙冬青毛狀根與其自然根兩組樣本呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，分別聚為一類，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的可靠性與重復(fù)性。

圖2 蒙古沙冬青毛狀根與自然根樣本的PCA得分

PCA作為一種反映原始數(shù)據(jù)狀態(tài)的無監(jiān)督方法，環(huán)境等其他因素以及系統(tǒng)錯(cuò)誤都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為排除由與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的某些因素引起的代謝變化，并獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究使用有監(jiān)督的OPLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理，最大化組間差異確定潛在的差異成分。在OPLS-DA分析中，Q2是一個(gè)重要的參數(shù)，Q2>0.9時(shí)被視為出色的模型，則可以反映該模型的可靠性與穩(wěn)定性。圖3顯示兩組樣本可以被明顯區(qū)分開來，在正、負(fù)離子模式下Q2分別為0.986和0.992，證實(shí)該模型可以用以下一步的差異代謝物分析。

圖3 蒙古沙冬青毛狀根與自然根樣本的OPLS-DA得分圖

經(jīng)過OPLS-DA置換檢驗(yàn)來驗(yàn)證模型是否過擬合，橫線對應(yīng)為原始模型的R2和Q2，藍(lán)點(diǎn)和紅點(diǎn)分別代表Y置換后模型的R2′和Q2′。R2′和Q2′均小于原始模型的R2和Q2，即相應(yīng)點(diǎn)都不超過相應(yīng)的線，說明模型有意義，可根據(jù)模型變量的變量權(quán)重值(VIP≥1)篩選差異代謝物，圖4顯示兩種模式下通過對OPLS-DA進(jìn)行排列驗(yàn)證，R2′和Q2′均小于原始模型的R2和Q2，表明可以用OPLS-DA模型來進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。

圖4 蒙古沙冬青毛狀根與自然根樣本的OPLS-DA模型驗(yàn)證圖

2.3 差異代謝物的篩選

在OPLS-DA分析中，模型變量的變量權(quán)重值VIP可以衡量各代謝物積累差異對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，挖掘具有生物學(xué)意義的差異代謝物。VIP≥1為常見的差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，本研究結(jié)合變化倍數(shù)log2FC≥2，統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)P-value<0.05為閾值進(jìn)行差異代謝產(chǎn)物篩選。在正、負(fù)離子模式下篩選出1 706和1 639種差異代謝物，其中表達(dá)上調(diào)的代謝物分別有1 455和1 095種。以代謝物在樣品中定量差異倍數(shù)的對數(shù)值(取以2為底的對數(shù))為橫坐標(biāo)，以t檢驗(yàn)的P-value(取以10為底的對數(shù))為縱坐標(biāo)，作差異代謝物火山圖(圖5)，散點(diǎn)大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點(diǎn)越大VIP值越大，篩選得到的差異表達(dá)代謝物越可靠。根據(jù)差異代謝物含量作聚類熱圖(見圖6)，由圖可以清晰看出蒙古沙冬青毛狀根與其自然根樣本間成分差異明顯，而組內(nèi)樣品成分差異較小。

圖5 蒙古沙冬青毛狀根與自然根差異代謝物火山圖

圖6 蒙古沙冬青毛狀根與其自然根差異代謝物聚類熱圖

2.4 差異代謝物注釋與通路富集分析

基于HMDB數(shù)據(jù)庫對KEGG數(shù)據(jù)庫注釋得到的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，利用ClusterProfiler選用超幾何檢驗(yàn)的方法對差異代謝物KEGG的注釋結(jié)果進(jìn)行富集分析差異代謝物通路，注釋到KEGG的差異代謝物在正、負(fù)離子模式下分別為171和134種，主要富集在8大類65條代謝通路：(1)基酸代謝(“苯丙氨酸代謝”“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝”“酪氨酸代謝”“精氨酸和脯氨酸代謝”“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”“氰基氨基酸代謝”“β-丙氨酸代謝”等18條)；(2)次生代謝產(chǎn)物生物合成(“黃酮/類黃酮生物合成”“生物堿生物合成”“β-內(nèi)酰胺菌素生物合成”“芥子油苷生物合成”“苯丙烷代謝”“有機(jī)氧化合物合成”等11條)；(3)碳水化合物代謝(“乙醛酸和二羧酸代謝”“半乳糖代謝”“抗壞血酸與醛酸代謝”“檸檬酸循環(huán)”“淀粉和蔗糖代謝”“丁酸酯代謝”等12條)；(4)脂質(zhì)代謝(“α-亞麻酸代謝”“亞油酸代謝”“脂肪酸合成”“花生四烯酸代謝”“甾族生物合成”等9條)；(5)輔助因子和維生素代謝(“泛酸和CoA生物合成”“泛醌和其他萜類醌生物合成”“維生素B6代謝”“生物素代謝”“煙酸和煙酰胺代謝”“硫胺素代謝”等7條)；(6)萜類和聚酮化合物代謝(“單萜生物合成”“玉米素生物合成”和“檸檬烯和蒎烯的降解”3條)；(7)能量代謝(“光合生物固碳”“硫代謝”和“氧化磷酸化”3條)；(8)核苷酸代謝(“嘧啶代謝”和“嘌呤代謝”2條)等通路。

在蒙古沙冬青毛狀根差異代謝產(chǎn)物主要富集的8類代謝通路中，氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物生物合成通路所占比重較大，這兩類通路在正離子模式下富集的差異代謝物分別占總差異代謝物的37.4%和32.7%，負(fù)離子模式下占28.4%和26.1%(見圖7)。在我們所關(guān)注的次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中涉及11條差異代謝通路(見圖8)：(1)黃酮/類黃酮生物合成；(2)生物堿生物合成；(3)β-內(nèi)酰胺菌素生物合成；(4)芥子油苷生物合成；(5)苯丙烷代謝；(6)苯并惡嗪類生物合成；(7)芪類、二芳基庚烷類和姜酚生物合成；(8)呋喃型木脂素；(9)酚類；(10)醇脂類；(11)有機(jī)氧化合物等。此途徑涉及50種差異代謝產(chǎn)物，其中34%的差異代謝產(chǎn)物富集在黃酮/類黃酮生物合成通路，占比最高；其次是生物堿生物合成通路中富集了24%的差異代謝物。在黃酮/類黃酮生物合成途徑中88.2%的差異代謝物呈現(xiàn)上調(diào)(高麗槐素、芒柄花素、芒柄花苷、降紫香苷、黃豆黃素、苜蓿毒素、芹菜苷等)(見表1)，初步預(yù)測蒙古沙冬青毛狀根組織對于黃酮/類黃酮物質(zhì)具有潛在的積累能力，有待進(jìn)一步深入挖掘研究。

圖7 差異代謝物KEGG通路富集圖

圖8 次生代謝產(chǎn)物生物合成通路富集圖

表1 黃酮/類黃酮生物合成通路差異代謝產(chǎn)物

3 討論與結(jié)論

本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對蒙古沙冬青毛狀根及其自然根進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在正、負(fù)離子模式下分別篩選到1 706和1 639種差異代謝產(chǎn)物，其中表達(dá)上調(diào)的代謝物分別有1 455和1 095種。二者的差異代謝物主要富集在氨基酸代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成代謝通路上，在次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中包含黃酮/類黃酮生物合成、生物堿生物合成、β-內(nèi)酰胺菌素生物合成、芥子油苷生物合成等11條代謝通路，黃酮/類黃酮生物合成通路涉及的差異代謝產(chǎn)物最多，占34%，其中88.2%差異代謝物呈現(xiàn)上調(diào)。類黃酮是一類2-苯基色原酮類化合物，按其骨架可分為查爾酮、黃烷酮、黃酮、黃酮醇、異黃酮、花青素和紫檀素等，而糖基化、丙二?；⒘u基化、異戊烯基化、乙?；揎椧约熬酆戏磻?yīng)最終導(dǎo)致了該化合物家族的多樣性，這些化學(xué)修飾對類黃酮的溶解性、移動性和降解性均有重要影響。類黃酮的結(jié)構(gòu)和分子特性的多樣性，使得它能與各類亞細(xì)胞中的靶標(biāo)相互作用，從而影響植物、微生物和動物的生物學(xué)活性，是植物發(fā)揮化學(xué)生態(tài)學(xué)功能的重要載體之一[19]。研究發(fā)現(xiàn)，從蒙古沙冬青種子中提取的總黃酮具有多種生物學(xué)活性，具有良好的免疫增強(qiáng)作用，對小鼠免疫活性細(xì)胞的增殖、相關(guān)免疫細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生與釋放等都具有顯著的促進(jìn)作用，沙冬青種子總黃酮的主要活性成分為芒柄花素，占總黃酮含量比高達(dá)52.48%[20-22]。通過本研究分析，初步判斷蒙古沙冬青毛狀根對黃酮/類黃酮物質(zhì)具有較強(qiáng)的合成積累能力，這與學(xué)者對蒙古沙冬青功效成分研究結(jié)果相近，說明其毛狀根組織擁有潛在的開發(fā)價(jià)值。在此代謝組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，后續(xù)需對其黃酮/類黃酮生物合成通路進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，并對毛狀根組織展開化學(xué)成分分離提取及活性鑒定等相關(guān)研究，為蒙古沙冬青毛狀根可否作為蒙藥沙冬青的活性代謝成分生產(chǎn)組織提供參考依據(jù)。