耿棟棟 蘇淑紅 杜慧清 王志方

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 特需病房，河南 新鄉(xiāng) 453000；3新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 急診科，河南 新鄉(xiāng) 453000；4新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科三病區(qū)，河南 新鄉(xiāng)453000

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，全世界每年有1 200萬(wàn)人死于心肌損傷。盡管過(guò)去幾十年來(lái)通過(guò)藥物和機(jī)械干預(yù)在心肌損傷的治療方面取得了進(jìn)展，但心肌損傷仍是死亡的主要原因。已經(jīng)確定，損傷程度的限制是減少心肌損傷后果的一個(gè)重要因素[1]。心肌缺血和心肌缺血再灌注后，活性氧的產(chǎn)生增加。研究[2]表明，活性氧在心肌損傷的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。異丙腎上腺素通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、心肌損傷和心肌細(xì)胞能量?jī)?chǔ)備的耗竭，引起復(fù)雜的生化和結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和壞死[3]。香葉木苷是一種不飽和黃酮，主要存在于牛膝草和迷迭香中[4]。香葉木苷具有抗炎、抗氧化和抗誘變的特性[5]。本研究通過(guò)建立異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷模型，探索香葉木苷對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟功能紊亂和氧化應(yīng)激的作用，以期為香葉木苷應(yīng)用于心肌損傷的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用45只SPF級(jí)健康成年雄性大鼠。鼠齡6～7個(gè)月，體質(zhì)量150～200 g，飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組(n=9)、異丙腎上腺素組(n=9)、香葉木苷低劑量組(n=9)、香葉木苷中劑量組(n=9)、香葉木苷高劑量組(n=9)。本研究通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器

Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；AMA440N 高壓滅菌鍋(英國(guó)Astell公司)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；OLYMPUS DP71顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)有限公司)；電泳槽，電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；ABI StepOnePlus TM 熒光定量PCR儀(美國(guó)基因儀器公司)；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP(美國(guó)UVP公司)。

1.3 藥品與試劑

香葉木苷和異丙腎上腺素(美國(guó)Sigma公司)；Bax，Bcl-2，Caspase-3，Survivin，Nrf2，PGC-1α，TFAM，Ki67抗體(美國(guó)NEB公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；蛋白Marker，F(xiàn)ermentas；EDTA 緩沖液(p H8.0)(武漢百耐特化工有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa(DRR037S))；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus，TaKaRa(DRR420A))；ECL 發(fā)光試劑盒，RIPA強(qiáng)裂解液(碧云天)；PVDF膜(谷歌生物)；大鼠CK、CKMB、c TnI ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；大鼠SOD，MDA，LDH 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 動(dòng)物模型建立與藥物干預(yù)

將異丙腎上腺素溶于生理鹽水中，每隔24 h皮下注射(100 mg/kg·d)大鼠，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性心肌梗死[6]。香葉木苷低、中、高劑量組大鼠分別用5、10、20 mg/kg劑量的香葉木苷口服給藥。每天給藥1次。連續(xù)給藥10周后處死小鼠，取心臟組織進(jìn)行相關(guān)研究。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 心臟功能指標(biāo)

每組大鼠治療10周后，檢測(cè)心率(HR)，記錄心電圖T 波變化，并通過(guò)BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄LVSP水平和LVEF水平。

1.5.2 ELISA 法測(cè)定外周血中心損標(biāo)記物CK、CKMB、c TnI的含量

每組大鼠治療10周后，取大鼠外周血，分離出血清。采用ELISA 法測(cè)定大鼠血清CK、CKMB、c TnI的含量。操作步驟嚴(yán)格按照大鼠CK、CKMB、c TnI ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.3 HE染色

每組大鼠治療10周后，麻醉處死大鼠取部分心臟組織放入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色:將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，以及體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自來(lái)水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片；光學(xué)顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

1.5.4 免疫組化分析

采用鏈霉親和素-生物素-復(fù)合過(guò)氧化物酶試劑盒對(duì)腫瘤組織中Ki67進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。最后，將載玻片沖洗、脫水并安裝在顯微鏡下檢查和計(jì)數(shù)免疫反應(yīng)細(xì)胞(黃色到棕色)。在與奧林巴斯顯微鏡相連接的Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)上對(duì)異種移植物的免疫染色進(jìn)行分析。在400×放大倍數(shù)下，通過(guò)計(jì)算黃色到棕色細(xì)胞和5個(gè)隨機(jī)選擇的視野中的細(xì)胞總數(shù)來(lái)定量Ki67染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞。

1.5.5 試劑盒檢測(cè)MDA、SOD、LDH 的含量

每組大鼠治療10周后，麻醉處死大鼠，取心肌組織，提取心肌細(xì)胞上清。分別采用SOD、MDA、LDH 試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞上清液SOD、MDA、LDH、GSH 的含量。操作步驟嚴(yán)格按照大鼠SOD、MDA、LDH、GSH 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.6 免疫印跡法

使用裂解緩沖液(Beyotime，Shanghai，China)裂解細(xì)胞樣品。然后，使用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Beyotime)定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE 中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；Caspase-3，1∶1 000；Survivin，1∶1 000；Nrf，1∶1 000；PGC-1α，1∶1 000；TFAM，1∶1 000于4 ℃封閉過(guò)夜，第2天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL，設(shè)置曝光參數(shù)，檢測(cè)目的條帶對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以表示。采用單因素方差分析，若方差齊則兩組間比較用LSD 法，若方差不齊則兩組間比較用Dunnett's法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香葉木苷保護(hù)異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠的心臟功能

如表1所示:與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組HR、LVSP和LVEF 均顯著降低(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組HR、LVSP和LVEF均顯著升高(P＜0.05)。

表1 不同組心臟功能指標(biāo)檢測(cè)

2.2 香葉木苷降低血清中CK、CKMB、cTnI的含量

如表2所示:與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組大鼠血清中CK、CKMB、c TnI含量均顯著升高(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組大鼠血清中CK、CKMB、c TnI含量均顯著降低(P＜0.05)。

表2 不同組血清中CK、CKMB、cTnI的含量

2.2 香葉木苷緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷

如圖1所示:對(duì)照組心肌細(xì)胞邊緣清晰，核膜完整，心肌纖維排列整齊，無(wú)細(xì)胞間物質(zhì)水腫；異丙腎上腺素組心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，明顯的細(xì)胞間物質(zhì)水腫，界限模糊，有少量交叉條紋；中、高劑量香葉木苷分別處理后，細(xì)胞間水腫減輕，心肌損傷介于異丙腎上腺素組和對(duì)照組之間。

圖1 不同組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

2.3 香葉木苷促進(jìn)心肌細(xì)胞中Ki67的表達(dá)

如圖2所示，對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量棕黃色顆粒，與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組僅見(jiàn)少量棕黃色顆粒。依次用低、中、高劑量的香葉木苷處理后，心肌細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒依次增多。如圖3所示，對(duì)照組、異丙腎上腺素組、香葉木苷低劑量組、香葉木苷中劑量組和香葉木苷高劑量組心肌細(xì)胞中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞分別為(58.45±5.21)%、(5.98±1.43)%、(9.12±2.41)%、(61.22±5.79)%。與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組心肌細(xì)胞中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組心肌細(xì)胞中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高(F=155.70，P＜0.05)。

圖2 免疫組化檢測(cè)Ki67的表達(dá)

2.4 香葉木苷促進(jìn)Survivin的蛋白表達(dá)，抑制Bax/Bcl和Caspase-3的蛋白表達(dá)

從圖4所示western-blot條帶中可看出:與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)量升高，Survivin蛋白表達(dá)量降低。香葉木苷中、高劑量組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)量較異丙腎上腺素組降低；Survivin蛋白表達(dá)量較異丙腎上腺素組升高。western-blot灰度分析結(jié)果見(jiàn)表3:與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，Survivin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)，Survivin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。

表3 不同組Bax/Bcl、Caspase-3和Survivin蛋白表達(dá)水平的western-blot灰度分析結(jié)果

圖4 不同組Bax/Bcl、Caspase-3和Survivin蛋白表達(dá)水平

2.5 香葉木苷對(duì)SOD、LDH活性及MDA含量的影響

如表4所示:與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組SOD活性顯著降低(P＜0.05)，MDA含量及LDH 活力均顯著升高(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組SOD 活性顯著升高(P＜0.05)，MDA 含量及LDH 活力均顯著降低(P＜0.05)。

表4 不同組SOD、MDA和LDH的含量

2.6 香葉木苷促進(jìn)PGC-1α，TFAM 蛋白表達(dá)和Nrf2的活性

如圖5所示:從western-blot條帶中可以看出，各組Nrf2總蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。異丙腎上腺素組p-Nrf2、PGC-1α，TFAM 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低。與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組p-Nrf2、PGC-1α，TFAM 蛋白表達(dá)量明顯升高。Western-blot灰度分析結(jié)果見(jiàn)表5，與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組p-Nrf2，PGC-1α，TFAM 蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)。與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組p-Nrf2，PGC-1α，TFAM 蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)。

表5 不同組大鼠心肌組織Nrf2、PGC-1a和TFAM 蛋白表達(dá)水平

圖5 不同組Nrf2、PGC-1a和TFAM 蛋白表達(dá)水平

3 討論

心肌損傷可引起心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變，從而影響心臟功能。HR 以及LVSP、LVEF 水平均為心臟功能的指標(biāo)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血/再灌注損傷能引起HR 和LVDP明顯降低，心臟功能受到破壞。Song[8]等報(bào)道稱miR-320治療后LVEF，LVFS，LVSP明顯升高，可改善心臟功能，緩解缺血再灌注損傷。與前人研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷治療后，HR、LVSP、LVEF 水平均升高，表明香葉木苷對(duì)心臟功能具有保護(hù)作用。

c TnI和CK、CKMB三種心肌損傷標(biāo)志物在心肌損傷診斷發(fā)揮著重要作用。異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死大鼠血清中CKMb含量的升高證實(shí)造成了心肌損傷。研究[4]發(fā)現(xiàn)香葉木苷通過(guò)降低CK、CKMB含量可阻斷過(guò)量異丙腎上腺素的毒性作用，抑制心臟損傷。同樣，Abdel-Daim[9]等通過(guò)HE 染色發(fā)現(xiàn)香葉木苷能明顯減輕心肌組織病理學(xué)損傷，在香葉木苷處理后，血清中CKMB 的濃度顯著降低。c Tn T 作為可收縮蛋白，是診斷人類和動(dòng)物心肌梗死模型的高度特異性和敏感性的標(biāo)志物，研究[10]發(fā)現(xiàn)，香葉木苷可降低異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死大鼠血清c TnI的水平，這可能是由于香葉木苷秦楚自由基的作用使心肌損傷程度下降所致。本研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷治療降低了大鼠血清中CK、CKMB、c TnI的含量，表明香葉木苷對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)性心血管疾病的發(fā)揮著重要作用。Ki67為增殖細(xì)胞中核抗原，表達(dá)量與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，而Survivin是凋亡抑制因子家族中一個(gè)獨(dú)特的成員，在細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡過(guò)程中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷通過(guò)降低Bax和Caspase-3的表達(dá)，對(duì)三氯乙烯誘導(dǎo)的腎損傷具有保護(hù)作用[11]。LIU[12]等研究發(fā)現(xiàn)高劑量的香葉木苷能顯著上調(diào)Bcl的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，對(duì)缺血再灌注損傷具有有效的抗凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷處理后，心肌細(xì)胞中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高。香葉木苷促進(jìn)Survivin的蛋白表達(dá)，抑制Bax/Bcl和Caspase-3的蛋白表達(dá)，表明香葉木苷促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡途徑，從而抑制細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是心肌損傷的主要病理因素。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)眾多與緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)，對(duì)于抵抗氧化應(yīng)激有重要的調(diào)節(jié)作用[13]。PGC-1α是線粒體重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控線粒體抗氧化狀態(tài)。PGC-1α與Nrf2 共激活可以調(diào)節(jié)TFAM 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體DNA 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。目前尚無(wú)香葉木苷對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2，PGC-1α，TFAM 影響的相關(guān)研究，而本研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷治療后，激活Nrf2通路，氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白PGC-1α和TFAM 表達(dá)水平升高，表明香葉木苷具有線粒體抗氧化的作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Abdel-Daim[9]等報(bào)道稱香葉木苷能夠降低MDA 的濃度，增加SOD 的活性，從而發(fā)揮抗氧化作用。研究[14]發(fā)現(xiàn)香葉木苷治療后，SOD的活性增加，LDH 活力降低，從而減輕氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷治療后，SOD 活性升高，MDA含量以及LDH 活力降低，表明香葉木苷具有抗氧化作用。

綜上所述，本研究通過(guò)建立異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷模型，香葉木苷可能通過(guò)直接或間接途徑激活Nrf2通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制其凋亡，緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟功能紊亂和氧化應(yīng)激，表明香葉木苷對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷具有緩解作用，為香葉木苷應(yīng)用于臨床治療心肌損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。