曲庭偉， 張文璇， 崔春梅， 姜人月， 鮑君鐸， 趙仁雙， 金 鑫*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.上海市銳翌生物科技有限公司，上海201199)

氣腫疽病，也稱為黑腿病，“黑腿”即為氣腫疽梭菌所引起的較為明顯的臨床癥狀，嚴(yán)格來講，該病典型臨床癥狀為患病動(dòng)物豐滿肌肉部位發(fā)炎、腫脹，施力觸壓時(shí)可聽到類似捻發(fā)音[1]。該病常呈急性發(fā)病，潛伏期較短，病情發(fā)展迅速，甚至有一些動(dòng)物在未出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)便死亡[2]。已經(jīng)患有此病的動(dòng)物和帶菌動(dòng)物是該病最主要的傳染源，如患病動(dòng)物的排泄物，或者外傷，都會(huì)造成食物、土壤、草料、飲水等的污染，從而導(dǎo)致該病的傳播[1]。病原菌侵入機(jī)體的具體經(jīng)過尚未有明確的闡述，但目前已知其主要的入侵途徑有2種：1) 是經(jīng)消化道黏膜破潰侵入機(jī)體；2) 進(jìn)入血液后隨血流到達(dá)機(jī)體內(nèi)部造成感染[2]。經(jīng)多位國(guó)外學(xué)者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，氣腫疽梭菌有以下幾種毒力因子：細(xì)胞毒素CctA、鞭毛蛋白FliA、唾液酸酶NanA[3-6]，此外，2017年Saroj K等研究表明，氣腫疽梭菌的基因組中含有2種不同的透明質(zhì)酸酶基因，可降解宿主體內(nèi)稱為透明質(zhì)酸的結(jié)締組織，即NagH和NagJ[7]，并證明透明質(zhì)酸酶參與降解細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)和組織連接，從而使氣腫疽梭菌及其毒素能夠在感染的宿主中傳播[7]。

氣腫疽病病程發(fā)展較快，主要預(yù)防手段為定期注射疫苗[8]。其中，核酸疫苗較普通疫苗有免疫保護(hù)力強(qiáng)，免疫保護(hù)力較持久，易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[9]。根據(jù)前人成功試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[10-12]，將pVAX1選做該次試驗(yàn)的表達(dá)載體，pVAX1作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)目的基因的表達(dá)載體,大小為3.0 kb,是基于pcDNA3.1上重建得到的新型真核表達(dá)載體,用卡那抗性代替安芐抗性篩選基因,能有效降低人類基因組重組的可能,且pVAX1載體為非融合載體,其產(chǎn)生的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然存在的蛋白質(zhì)幾乎相同[13]。故該試驗(yàn)以氣腫疽梭菌NagH基因和pVAX1載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建pVAX1-NagH真核表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)BALB/c小鼠肌肉注射pVAX1-NagH核酸疫苗，以觀察該核酸疫苗是否會(huì)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞

延邊株氣腫疽梭菌、pVAX1載體、Vero細(xì)胞均于延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)預(yù)防實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及引物

1.2.1 主要試劑

pMD18-T Simple載體，連接緩沖液SolutionI，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒無內(nèi)毒素DNA大量提取試劑盒，購(gòu)自上海萊楓生物技術(shù)有限公司；Mouse IgG1 ELISA KIT、Mouse IgG2a ELISA KIT、Mouse IL-4 ELISA Kit、Mouse IFN-γELISA Kit，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物有限公司；LipofectamineTM6 000，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITCRat Anti-Mouse IgG,購(gòu)自艾美捷科技；DMEM低糖培養(yǎng)基(含葡萄糖，HEPES,青霉素和鏈霉素)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 引物

為了方便后期真核表達(dá)載體的構(gòu)建，在上游添加了Kozak序列(加粗部分)(表1)。

表1 引物核苷酸序列

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡雌性BALB/c小鼠，24只，購(gòu)自吉林億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 方法

1.4.1 pVAX1-NagH真核表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，并將凝膠回收產(chǎn)物與pVAX1載體連接。按照如下體系混和：目的基因NagH片段4 μL,載體1 μL,連接緩沖液Solution I 10 μL；16 ℃連接12 h；將連接物轉(zhuǎn)化至50 μLTrans5α感受態(tài)細(xì)胞中，使用涂布棒，在超凈工作臺(tái)中將其均勻涂布在含有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取平板上清晰單個(gè)菌落，接種到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩過夜，次日提取連接物的質(zhì)粒，所得質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將鑒定為陽(yáng)性的產(chǎn)物送往哈爾濱擎科嘉美生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4.2 重組質(zhì)粒pVAX1-NagH的表達(dá)分析

1.4.2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-NagH的轉(zhuǎn)染

在DMEM無雙抗培養(yǎng)液中加入生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Vero細(xì)胞進(jìn)行傳代，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長(zhǎng)至約鋪滿80%板底的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取3 μL LipofectamineTM6 000和97 μLOpti-MEM培養(yǎng)液混合均勻，制備成混合液1；取10 μL pVAX1-NagH質(zhì)粒與90 μL Opti-MEM培養(yǎng)液，制備成混合液2，混合均勻后靜置5 min。將混合液1和混合液2混勻后室溫靜置30 min。將DMEM無雙抗培養(yǎng)液換成Opti-MEM培養(yǎng)液，對(duì)24孔板中的Vero細(xì)胞清洗2次。每孔加入500 μL的培養(yǎng)液(Opti-MEM), 37 ℃培養(yǎng)5 h后棄廢液，最后在每孔中加1.5 mL DMEM低糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。

1.4.2.2 IFAT檢測(cè)NagH基因的表達(dá)

在轉(zhuǎn)染后，丟棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入10%冷丙酮，固定10 min，再次用PBS緩沖液清洗2次，向各孔中加入500 μL稀釋后的一抗(鼠抗氣腫疽梭菌NagH)，37 ℃靜置90 min，用PBS緩沖液清洗3次。再向各孔中加500 μL稀釋后的二抗(FITCRat Anti-Mouse IgG),37 ℃靜置60 min，最后用PBS清洗3次。在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.3 動(dòng)物試驗(yàn)

24只5周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，分別為pVAX1-NagH組，pVAX1組，PBS組進(jìn)行免疫，該試驗(yàn)采用雙側(cè)股四頭肌注射法進(jìn)行免疫，方法為每間隔14 d免疫1次；分別在1免(0 d)前，2免(14 d)前，3免(28 d)前和所有免疫結(jié)束后進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清。免疫策略見表2。

1.4.3.1 檢測(cè)小鼠血清中IgG的指標(biāo)水平

取100 μL用ELISA包被液(碳酸鹽緩沖溶液)稀釋的NagH抗原(25 μg/mL)加入到96孔板中，4 ℃靜置過夜；棄廢液后每孔加入150 μL PBST進(jìn)行洗板，每5 min重復(fù)1次，共重復(fù)3次；使用含2%脫脂乳的PBST封閉液，進(jìn)行封閉，37 ℃避光靜置2 h；將待測(cè)血清100倍稀釋后，每孔加100 μL,37 ℃避光靜置1 h，結(jié)束后進(jìn)行3次洗板；將HRP Rat Anti-Mouse IgG與PBS緩沖液按照1∶5 000的比例混合稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃避光靜置1 h，結(jié)束后進(jìn)行3次洗板；每孔加100 μL OPD顯色液，室溫避光15 min；每孔加50 μL終止液，參考以往成功試驗(yàn)[10-11]的酶標(biāo)儀波長(zhǎng)條件，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定其OD值。

1.4.3.2 檢測(cè)小鼠血清中IgG1、IgG2a、IFN-γ、IL-4的指標(biāo)水平

按照相應(yīng)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清中IgG1、IgG2a、IFN-γ、IL-4水平。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

該試驗(yàn)采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFAT檢測(cè)NagH基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的Vero細(xì)胞在顯微鏡下有綠色熒光出現(xiàn)，而另外2組細(xì)胞在鏡下均無熒光。說明pVAX1-NagH質(zhì)粒中的NagH基因能夠在Vero細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)(圖1)。

A: pVAX1-NagH(200×); B: pVAX1對(duì)照組(200×); C: 正常細(xì)胞對(duì)照組(200×)

2.2 免疫效果評(píng)價(jià)

2.2.1 小鼠血清中IgG指標(biāo)變化

應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)方法來測(cè)定血清中IgG水平，可見pVAX1-NagH組在第1次免疫后，抗體水平持續(xù)上升，且顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組免疫小鼠血清中IgG指標(biāo)變化

2.2.2 小鼠血清中IgG1指標(biāo)變化

Mouse IgG1 ELISA KIT檢測(cè)小鼠血清IgG1水平。可見pVAX1-NagH組在免疫后的抗體水平總體呈上升趨勢(shì)，雖然在第3次免疫后上升趨勢(shì)并不顯著，但始終顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 各組免疫小鼠血清中IgG1指標(biāo)變化

2.2.3 小鼠血清中IgG2a指標(biāo)變化

Mouse IgG2a ELISA KIT檢測(cè)小鼠血清IgG2a水平。可見pVAX1-NagH組在免疫后的抗體水平顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1載體組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 各組免疫小鼠血清中IgG2a指標(biāo)變化

2.2.4 小鼠血清中IFN-γ指標(biāo)變化

Mouse IFN-γELISA KIT檢測(cè)小鼠血清IFN-γ水平?？梢妏VAX1-NagH組在免疫后的抗體水平在免疫后的前28 d中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且顯著高于pVAX1組和PBS組(P<0.05)，但其抗體水平在第4次檢測(cè)時(shí)未能維持在最高水平，而呈現(xiàn)了下降趨勢(shì)。pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

圖5 各組免疫小鼠血清中IFN-γ指標(biāo)變化

2.2.5 小鼠血清中IL-4指標(biāo)變化

Mouse IL-4 ELISA KIT檢測(cè)小鼠血清IL-4水平。可見pVAX1-NagH組在免疫后的抗體水平顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 各組免疫小鼠血清中IL-4指標(biāo)變化

3 討論與結(jié)論

近年來，我國(guó)對(duì)氣腫疽疾病的控制已經(jīng)達(dá)到良好成效，在預(yù)防方面做了充分準(zhǔn)備，定期注射疫苗，加強(qiáng)衛(wèi)生治理，減少體表創(chuàng)傷，提高畜舍管理水平[8]。免疫是機(jī)體的一種特異性生理反應(yīng), 通過識(shí)別和排除抗原性異物維持體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。動(dòng)物機(jī)體的免疫功能是在淋巴細(xì)胞和其他有關(guān)細(xì)胞及產(chǎn)物的相互作用下完成的, 這些具有免疫作用的細(xì)胞及產(chǎn)物以及與其相關(guān)的組織和器官, 構(gòu)成了機(jī)體的免疫系統(tǒng)[14]。在引物設(shè)計(jì)過程中，參考以往成功試驗(yàn)[9,15]，加入了Kozak序列，增強(qiáng)了翻譯的效率。在注射疫苗時(shí)，采用了雙側(cè)股四頭肌注射法進(jìn)行免疫，據(jù)稱，肌肉注射DNA比其他組織攝取DNA的效率高100～1 000倍, 故該試驗(yàn)采用雙側(cè)股四頭肌注射法進(jìn)行免疫[16]。

在機(jī)體免疫過程中,Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答,殺滅細(xì)菌和病毒等病原體,主要生產(chǎn)IFN-γ, IL-2和TNF-β等[17]，其通過刺激B細(xì)胞的增殖分化,在IFN-γ的輔助作用下促進(jìn)IgG2a的產(chǎn)生,而Th2主要參與體液免疫應(yīng)答在變態(tài)反應(yīng)性疾病中發(fā)揮作用,主要產(chǎn)生IL-4、IL-6和IL-10等[18]，其在IL-4的輔助作用下促進(jìn)IgG1的產(chǎn)生,Th1和Th2通過相互協(xié)調(diào)作用,共同完成機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[17-20]。該試驗(yàn)通過檢測(cè)IFN-γ、IgG2a作為Th1細(xì)胞免疫水平的依據(jù),通過檢測(cè)IL-4、IgG1水平作為體液免疫水平的依據(jù)。

結(jié)果顯示在接受了免疫接種后，通過對(duì)血清抗體含量的分析發(fā)現(xiàn)，各組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的免疫反應(yīng)。其中，pVAX1-NagH免疫組的小鼠血清抗體水平逐漸上升，且IgG1與IgG2a水平高于pVAX1空載體組和PBS對(duì)照組，IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子水平高于pVAX1空載體組和PBS對(duì)照組，IgG1、IgG2a、IL-4和IFN-γ指標(biāo)在小鼠血清中的水平不但與對(duì)照組形成顯著差異，而且在最后一次接種后2周的時(shí)間里能夠始終保持在較高水平。說明pVAX1-NagH疫苗組明顯能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。但根據(jù)第42天的檢測(cè)結(jié)果顯示，IFN-γ的水平出現(xiàn)了一定程度的下降，該情況的出現(xiàn)可能由多種原因?qū)е拢@可能顯示著該重組質(zhì)粒不能很好地引起小鼠血清中IFN-γ水平的升高，對(duì)細(xì)胞免疫效果并未達(dá)到理想狀態(tài)。就此次試驗(yàn)而言，亦不能完全排除飼養(yǎng)等人為因素造成一定誤差的可能。

根據(jù)以往成功試驗(yàn)結(jié)果[10-11,21]，分析可得NagH的核酸疫苗免疫效果與FliA、NanA和CctA的免疫效果趨勢(shì)相近，說明NagH與FliA、NanA、CctA同樣可以起到刺激小鼠免疫反應(yīng)的作用，在預(yù)防氣腫疽梭菌疾病和維護(hù)公共衛(wèi)生安全方面更進(jìn)一步。