簡鳳嬌，李孝棟

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，截至2019年，全球新增癌癥病例2 360 萬例，以化療為主的腫瘤治療過程中，骨髓抑制是最常見的毒副反應，而白細胞減少癥是骨髓抑制的突出表現(xiàn)［1-2］。臨床上，西醫(yī)治療白細胞減少癥的方法主要有口服或注射升白藥物、成分輸血以及胚胎干細胞移植等，短期療效確切，但常伴有不良反應且費用昂貴［3-4］。中藥具有多靶點、長效、毒副作用小的優(yōu)勢，但存在使用周期長、見效慢的缺點，而由有效部位組成的中藥制劑可提高中藥的治療效果［5］。本研究中的參白方出自譚支紹教授主編的《藥用寄生》，方中取銀耳12 g、絞股藍45 g、黃芪和黨參各30 g 用清水共煎煮，長期服用可防治癌癥放化療導致的白細胞減少癥［6］。參白方的傳統(tǒng)提取工藝雖然簡單，但有效成分提取不完全，起效慢。通過前期文獻查閱與預實驗［7-10］，表明總多糖與總皂苷是參白方的主要有效部位。故本研究先采用水提醇沉的方法提取參白方中銀耳、黃芪和黨參中的總多糖，再將藥渣與絞股藍合并，先乙醇回流提取后再用水飽和正丁醇萃取獲得總皂苷。以總多糖和總皂苷的提取率及含量作為正交優(yōu)化總多糖和總皂苷的提取工藝的評價指標，為參白方的制劑研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-9600 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；AR-2140 十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 乙醇（湖南湘易康制藥有限公司，批號：100320170322）；香草醛（北京市芳草醫(yī)藥化工研制公司，批號：860718）；人參皂苷Rg1對照品（批號：110703201933，純度≥98.0%）、D-無水葡萄糖對照品（批號：110833200302，純度≥98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；分析純冰醋酸（批號：2102191）、正丁醇（批號：1601011）、苯酚（批號：171116）均購自西隴科學股份有限公司；甲醇（批號：20190320）、高氯酸（批號：10076732）、濃硫酸（批號：20201222）均購自國藥集團化學試劑有限公司。黃芪、絞股藍、銀耳、黨參均購自福州閩侯上街致誠藥店，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定為合格藥材，符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

2 方法與結果

2.1 總多糖含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取銀耳2.0 g、黃芪和黨參各 5.0 g，浸泡 30 min，加入 25 倍水煎煮 3次，每次4 h，過濾，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL；加入4 倍量95%乙醇，靜置過夜，過濾，濾餅干燥即得總多糖粗品；精密稱取總多糖粗品5.06 mg 于50 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得每1 mL 含0.101 mg 總多糖的供試品溶液，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品25.13 mg 于25 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得每1 mL 含1.005 mg 的D-無水葡萄糖對照品溶液，備用。

2.1.3 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 量瓶中，加入新配的5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加入濃硫酸5 mL，沸水浴加熱15 min 后，取出，置冰水浴冷卻10 min，用紫外可見分光光度計于490 nm波長處測定吸光度值，隨行空白。以對照品濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y＝8.45x＋7.92×10-2，r＝0.998 3。結果表明：D-無水葡萄糖在0.010 0～0.060 3 mg/mL 濃度范圍與吸光度值呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 量取同一份對照品溶液，按“2.1.3”項下方法，重復測定吸光度值6次。測得吸光度的平均值為0.450，RSD為0.86%，結果表明該儀器精密度良好。

2.1.5 重復性考察 分別制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項下方法平行測定吸光度值，計算供試品溶液中總多糖平均含量為43.114%，RSD為0.62%，結果表明該方法的重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 量取同一份供試品溶液，按“2.1.3”項下方法，分別在0、15、30、45、60、90、120 min時測定吸光度值。測得吸光度平均值為0.431，RSD為1.08%，結果表明供試品溶液在2 h 內穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率實驗 精密量取6 份已知含量的供試品溶液各0.5 mL，分別加入對照品溶液各20 μL，按“2.1.3”項下方法測定吸光度值。結果見表1，表明該方法準確度良好。

表1 加樣回收率實驗結果

2.2 總皂苷含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取絞股藍7.5 g，合并多糖提取濾渣，加入8倍量由“2.1.1”項下所得醇沉液配制的80%乙醇，浸泡30 min，提取2 h，過濾；濾渣再加入8 倍量80%乙醇，同法提取，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL；每次加入3 倍量水飽和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷粗品；將所得總皂苷粗品適量溶于25 mL量瓶中，加入蒸餾水稀釋至刻度，即得每1 mL 含1 mg 的總皂苷的供試品溶液，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品10.04 mg 置于25 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，稀釋至刻度，即得每1 mL 含0.402 mg 的人參皂苷Rg1對照品溶液，備用。

2.2.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于10 mL 量瓶中，100℃水浴揮干后，冷卻，加入新配的5%香草醛溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴加熱15 min，取出，立即用冰水冷卻，精密加入冰醋酸5 mL 后，用紫外分光光度計于550 nm 波長下測定吸光度值，隨行空白。以對照品濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y＝1.01×10-2x－1.02×10-2，r＝0.999 1。結果表明：人參皂苷Rg1 在0.016 1～0.064 3 mg/mL 濃度范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 量取同一份對照品溶液，按“2.2.3”項下方法，重復測定吸光度值6次。測得吸光度的平均值為0.393，RSD為0.45%，結果表明該儀器精密度良好。

2.2.5 重復性考察 分別制備6 份供試品溶液，按“2.2.3”項下方法平行測定吸光度值，計算供試品溶液中總皂苷平均含量為33.639%，RSD為0.28%，結果表明該方法的重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 量取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項下方法，分別于0、15、30、45、60、90、120 min時測定吸光度值。測得吸光度平均值為0.287，RSD為1.06%，結果表明供試品溶液在2 h 內穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率實驗 精密量取6 份已知含量的供試品溶液各1.5 mL，分別加入人參皂苷Rg1對照品溶液各0.1 mL，按“2.2.3”項下方法測定吸光度值。結果見表2，表明該方法準確度良好。

表2 加樣回收率實驗結果

2.3 正交優(yōu)化試驗

2.3.1 總多糖提取的正交試驗 參考相關文獻與預實驗結果，選取提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）為考察因素，平行操作條件下，以總多糖的提取率與含量為評價指標，按L9（34）正交表設計實驗，見表3。分別稱取9 份銀耳2.0 g，黨參、黃芪各5.0 g，根據(jù)正交因素水平表，按“2.1.1”項下方法提取得總多糖粗品。精密量取0.1 mg/mL 總多糖溶液1 mL，按“2.1.3”項下方法，測定總多糖的吸光度值，并計算總多糖含量。結果見表4～表5。

表3 總多糖提取的正交試驗因素水平表

表4 總多糖提取的正交試驗結果

表5 總多糖提取的正交試驗方差分析表

由表5 方差分析可知：提取時間、提取次數(shù)、料液比對總多糖含量影響均不顯著（P＞0.05），選擇的3 個因素對實驗結果的影響，由大到小為A＞B＞C，總多糖的優(yōu)選提取工藝條件為A3B3C2，即料液比為1∶20，提取3次，每次4 h，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL，加入4 倍量95%乙醇，靜置過夜，過濾，濾餅干燥即得總多糖粗品。

2.3.2 總皂苷提取的正交試驗 根據(jù)相關資料與預實驗結果，選取提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）為考察因素，平行操作條件下，以總皂苷的提取率與含量為評價指標，按L9（34）正交表設計實驗，見表6。分別稱取9份絞股藍7.5 g，根據(jù)正交因素水平表，按“2.2.1”項下方法提取得總皂苷粗品。精密量取1 mg/mL 總皂苷溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法，測定吸光度值并計算總皂苷含量。結果見表7～表8。由方差分析可知：提取時間、提取次數(shù)、乙醇濃度、料液比對總皂苷含量影響均不顯著（P＞0.05），選擇的4個因素對實驗結果的影響，由大到小為B＞C＞D＞A，總皂苷的最佳提取工藝條件為A3B2C2D1，即料液比為1∶8，用80%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL，每次加入3 倍量水飽和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷粗品。

表6 總皂苷提取的正交試驗因素水平表

表7 總皂苷提取的正交試驗結果

表8 總皂苷提取的正交試驗方差分析表

2.4 工藝驗證 分別稱取3 份與正交試驗相同批次的各個藥材，分別按“2.3.1 ”與“2.3.2 ”項下方法提取總多糖粗品與總皂苷粗品，并計算其提取率與含量。結果見表9～表10。

表9 總多糖最優(yōu)提取工藝驗證結果

表10 總皂苷最優(yōu)提取工藝驗證結果

所得結果與正交試驗結果最大值比較，相差不大，由此可判斷，優(yōu)選的工藝可行、穩(wěn)定。

3 討 論

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，但因其成分眾多、復雜，也造成了中藥制劑服用量大，起效慢，故分離純化中藥有效成分或部位，減量增效是中藥現(xiàn)代化開發(fā)的有效思路之一。通過文獻的查閱，對參白方中各藥味有效部位的分析，結合前期藥效預實驗，表明參白方中總多糖和總皂苷具有升高白細胞水平的作用，故本實驗對參白方中總多糖和總皂苷的提取進行工藝優(yōu)化研究。傳統(tǒng)中藥復方的提取液中成分眾多，給有效成分的分離純化帶來諸多不便。而本實驗在提取階段便分離出所需的有效部位粗品，為后期進一步純化處理奠定基礎。

參白方中提取的總多糖為粗多糖，硫酸能夠將多糖先水解為單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，并與苯酚生成橙黃色化合物，采用硫酸-苯酚法能夠準確測定總多糖的含量，同時可以避免粗總多糖中蛋白的影響，且顯色較為穩(wěn)定［11］。結合文獻以及2020 版《中華人民共和國藥典》對多糖的含量測定，以D-無水葡萄糖作為指標成分。參白方中提取的總皂苷主要以絞股藍皂苷為主，而人參皂苷Rg1是絞股藍皂苷中具有升高白細胞水平作用的主要成分之一［12］，故以人參皂苷Rg1為總皂苷含量測定的指標成分。

總多糖與總皂苷提取的正交試驗設計以含量和提取率為評分指標，通過查閱文獻，設計綜合評分權重為含量占比70%，提取率占比30%。主要考慮到本實驗提取的總多糖和總皂苷為粗品，其含量能反映該提取工藝對后期分離純化的影響；同時以提取率作為輔助指標，能全面反映提取工藝的優(yōu)劣。在前期的單因素實驗中，分別考察了提取時間（1、2、3、4、5 h）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對銀耳、黃芪和黨參中總多糖提取的影響，結果表明：隨著提取時間、提取次數(shù)和料液比的增加，總多糖的得率及含量逐漸增加，分別在提取4 h、提取3次和料液比為1∶25 時達到峰值，而提取 3 h 和 5 h 對總多糖提取的影響相當，考慮時間成本，設計正交試驗優(yōu)化的因素和水平。同樣，分別考察了提取時間（1、2、3、4、5 h）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14）和乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對參白方中總皂苷回流提取的影響，結果表明：分別在提取2次和料液比為1∶10 之后，總皂苷的提取率在逐漸下降，而提取2 h 和乙醇濃度為80%時，最有利于總皂苷的提取，故設計正交試驗優(yōu)化總皂苷提取的因素和水平。

總皂苷提取工藝優(yōu)化結果表明：回流提取次數(shù)對總皂苷的提取影響較大，提取時間與料液比影響較小，如果考慮到節(jié)約試劑和時間成本，可以適當調整提取時間和料液比。從本次正交試驗中可以發(fā)現(xiàn)：總多糖的提取率達到15%，總皂苷提取率可達12%，含量為30%～50%，可根據(jù)需要考慮是否進一步純化，以提高總多糖與總皂苷的含量。本實驗對參白方中多個有效部位提取工藝的優(yōu)化能為中藥復方的提取工藝提供有益啟示，也為中藥制劑的進一步開發(fā)奠定基礎。