劉 潔 ，彭 嬌 ，趙錦燕 ，2，3，林明和 ，林久茂 ，2，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

宮頸癌是一種多發(fā)于宮頸部位的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅全球女性健康和生命安全［1-3］。目前，研究表明宮頸癌與高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染相關(guān)，其中與HPV16型和 18 型的相關(guān)率達 70%［4-6］。已發(fā)現(xiàn) Caski 細胞包含高危型 HPV16 病毒［7］，因此，針對 Caski 細胞的研究，對探討宮頸癌治療新途徑具有重要意義。清解扶正顆粒（Qingjie Fuzheng Granules，QFG）由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤科協(xié)定方（清解扶正方）改劑研制而成，組成為白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽，具有清熱解毒、扶正益氣的功效。本課題組前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)QFG 對Caski 細胞活力及生長具有明顯的抑制作用，但QFG 對宮頸癌的作用及其可能機制至今尚未有報道。因此本研究通過建立人宮頸癌Caski 細胞裸鼠皮下移植瘤模型，探討QFG 對人宮頸癌Caski 細胞移植瘤生長的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物和配制方法 QFG 由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供，動物實驗時稱取QFG 粉末200 mg 于離心管內(nèi)，加1 mL 生理鹽水進行溶解，配制濃度為200 mg/mL QFG 溶液。

1.2 實驗動物及細胞 4周齡SPF 級雄性BALB/c裸鼠12只，體質(zhì)量18～20 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2014-0017，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物實驗室，許可證號：SYXK（閩）2009-0001；宮頸癌Caski 細胞株購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Life Technologies 公司）；細胞凋亡TUNEL 檢測試劑盒（中國凱基生物技術(shù)有限公司）；B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 基因相關(guān) X 蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體均購自美國CST 公司；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀均購自美國Thermo公司；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；全自動細胞計數(shù)儀（美國Life Technologies 公司；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica 公司）。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)和宮頸癌Caski 移植瘤模型建立 Caski 細胞株培養(yǎng)于含有10%FBS、1%雙抗（含100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素）的 DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞貼壁生長，取對數(shù)生長期細胞制備細胞懸液（密度為5.0×107個/mL），皮下接種于12只BALB/c 裸鼠右前肢腋窩處（200 μL/只）。接種4～5 d 后，當(dāng)裸鼠右側(cè)腋窩下生成綠豆大小移植瘤，即可判定模型建立成功。

1.4.2 動物分組和給藥方法 待瘤體生長至大于70～100 mm3后，根據(jù)瘤體體積的大小隨機將12只裸鼠分為對照組和QFG組，每組各6只，分組當(dāng)天立即給藥。QFG組：依據(jù)臨床等效劑量換算，按5 mL/（kg·d）灌服 200 mg/mL QFG 溶液。對照組：每只裸鼠灌服與QFG組等劑量的生理鹽水。2組裸鼠1周連續(xù)給藥 6 d，每天1次，共給藥6周。

1.4.3 檢測瘤體體積、體質(zhì)量 給藥期間每2 d 用游標(biāo)卡尺測量裸鼠瘤體的長（L）及寬（W），計算瘤體體積；同時，用電子天秤稱量每只裸鼠的體質(zhì)量。瘤體體積計算公式：

瘤體體積＝π/6×L×W2

1.4.4 稱取瘤重、計算抑瘤率及采集相關(guān)標(biāo)本 停藥24 h 后對裸鼠脫頸處死，剝離瘤組織，觀察瘤體有無臟器轉(zhuǎn)移，稱取瘤重，計算抑瘤率，并隨機選取3 個瘤體進行拍照。將每個瘤體切分成2 份，1 份裝于1.5 mL 離心管內(nèi)暫放冰上，后續(xù)用于提取蛋白，進行Western blot 檢測；另1 份裝于含有4%多聚甲醛溶液的離心管內(nèi)進行固定，后續(xù)用于TUNEL 染色。抑瘤率計算公式為：

抑瘤率＝［1－（治療組瘤重/對照組瘤重）］×100%

1.4.5 TUNEL 法檢測瘤體組織細胞凋亡 將剝離的腫瘤組織包埋、速凍后立即進行冰凍切片（厚度4 μm），切片經(jīng)二甲苯、酒精脫蠟至水；用PBS 緩沖液沖洗（5 min×3次），再滴加1% Triton X-100 通透液于室溫下放置5 min；用TUNEL 免疫熒光試劑漂染腫瘤石蠟標(biāo)本切片，37℃避光孵育1 h，PBS 漂洗切片2次；加入DAPI 染料于避光的環(huán)境中室溫孵育15 min，PBS 漂洗3次；滴加適量抗熒光猝滅劑，蓋玻片封片，在避光的環(huán)境中將切片于電子熒光顯微鏡下觀察，其中熒光綠色為陽性細胞，熒光藍色為區(qū)域總細胞，計算瘤體組織細胞凋亡率，凋亡率計算公式為：

凋亡率＝陽性細胞數(shù)/區(qū)域總細胞數(shù)×100%

1.4.6 Western blot檢測瘤體組織蛋白表達水平 采用勻漿法對瘤體組織蛋白進行提取，采用二喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白量。蛋白液體中加入適量上樣緩沖液在100℃金屬浴中進行熱變性，完成蛋白制備；每份取50 μg 依次進行蛋白樣品上樣，于聚丙烯酰胺凝膠中電泳后進行轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉對目的膜進行封閉1 h；然后于含有0.25% Tween-20 的 TBST 中漂洗 15 min（5 min/次，共3次），最后孵育目的一抗（GAPDH、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、p-AKT；一抗稀釋比例為1/1 000）4℃搖床過夜。次日，孵育相對應(yīng)的二抗1 h（稀釋倍數(shù)1/5 000），最后滴加顯影液，Bio-Rad 成像系統(tǒng)對蛋白條帶進行成像，用Image J 軟件對蛋白灰度值進行數(shù)據(jù)分析。以Bax 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值、Bcl-2 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值分別得出Bax 和Bcl-2 相對蛋白表達量，以p-AKT 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值、AKT 蛋白灰度值/GAP?DH 蛋白灰度值分別得出p-AKT 和AKT 相對蛋白表達量，最后計算Bax/Bcl-2、p-AKT/AKT 比值：

Bax/Bcl-2＝Bax 相對蛋白表達量/Bcl-2 相對蛋白表達量

p-AKT/AKT＝p-AKT 相對蛋白表達量/AKT 相對蛋白表達量

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料服從正態(tài)分布以（）表示，采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 2組裸鼠體質(zhì)量比較 與對照組比較，QFG組裸鼠體質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05），見圖1。

圖1 2組裸鼠體質(zhì)量比較

2.2 2組裸鼠瘤體體積比較 見圖2。對照組瘤體生長快速，瘤體生長曲線波動幅度大；而QFG組裸鼠前3周瘤體體積與對照組并無明顯差異（P＞0.05），后3周瘤體體積波動幅度小，與對照組比較有顯著差異（P＜0.05）。同時，從圖2B 也可看出QFG組瘤體體積，相較于對照組明顯減小。

圖2 2組裸鼠瘤體體積比較

2.3 2組裸鼠瘤重量及抑瘤率比較 見表1。

表1 2組裸鼠瘤重量、抑瘤率比較（）

表1 2組裸鼠瘤重量、抑瘤率比較（）

注：與對照組比較，1）P＜0.01。

抑瘤率/%0.00±0.00 79.72±0.151）組別對照組QFG組例數(shù)6 6瘤重量/g 0.59±0.12 0.12±0.041）

2.4 2組裸鼠瘤體組織細胞凋亡情況比較 見圖3。圖 3 顯示：對照組凋亡率為（5.24±0.57）%，QFG組凋亡率為（13.6±2.08）%，QFG組細胞凋亡率明顯增多（P＜0.05）。

圖3 2組裸鼠瘤體組織細胞凋亡情況比較（×200）

2.5 2組裸鼠瘤體組織Bax、Bcl-2 蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 比較 見圖4。圖4 顯示：與對照組比較，QFG組 Bax 蛋白表達水平增加，Bcl-2 蛋白表達水平降低，Bax/Bcl-2 明顯增高（P均＜0.05）。

圖4 2組裸鼠瘤體組織Bax、Bcl-2 蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 比較

2.6 2組裸鼠瘤體組織 PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表達水平及p-AKT/AKT 比較 見圖5。圖5 顯示：與對照組比較，QFG組PI3K、p-AKT 蛋白表達水平明顯降低（P均＜0.05），AKT 蛋白表達水平無明顯差別（P＞0.05），但p-AKT/AKT 降低（P＜0.05）。

圖5 2組裸鼠瘤體組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平及p-AKT/AKT 比較

3 討 論

宮頸癌屬中醫(yī)“崩漏”“瘕聚”范疇。主要由臟腑氣血失調(diào)，濕毒侵積于下，沖任二脈受損而成。治療本病以扶正祛邪、消疒征散結(jié)為原則。中藥復(fù)方QFG組方中白花蛇舌草、半枝蓮對宮頸癌等多種惡性腫瘤具有良好的抑制作用［8-11］，可通過多成分、多靶點、多通路參與宮頸癌細胞凋亡［12］；炙黃芪、炒麥芽益氣健脾，可緩解患者長期放化療產(chǎn)生的毒副作用，提高宮頸癌患者自身免疫力［13］。前期預(yù)實驗也發(fā)現(xiàn)QFG 可抑制宮頸癌Caski 細胞活力及生長，但QFG 對宮頸癌的作用及其機制，還有待進一步研究。

本研究結(jié)果顯示：QFG 對人宮頸癌Caski 細胞移植瘤生長具有明顯抑制作用，包括降低瘤體體積、瘤重和增加抑瘤率；同時，QFG 可增加瘤體組織中細胞凋亡率。由此可見QFG 可能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，進而發(fā)揮對宮頸癌Caski 細胞移植瘤生長的抑制作用。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是由基因主動決定的自動結(jié)束生命的過程［14］。在細胞凋亡過程中，Bcl-2 家族扮演重要角色，其通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)凋亡激活物如細胞色素C 的釋放，從而影響細胞的凋亡。Bax 二聚體可以打開線粒體膜，增加膜通透性；Bcl-2 可以與Bax 形成異聚體，Bcl-2 增加，線粒體膜通透性隨之降低；Bax/Bcl-2增加可說明細胞凋亡增加［15］。本研究結(jié)果也表明QFG 增加Bax/Bcl-2，說明QFG 可促進細胞凋亡。

PI3K/AKT 信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［16］。已有報道，PI3K/AKT 信號通路對細胞凋亡具有直接或間接的調(diào)控作用［17］。直接調(diào)控作用表現(xiàn)在活化的AKT 會抑制BAD 磷酸化、促進Bax 的Ser184 位點磷酸化，抑制細胞凋亡；間接調(diào)控作用表現(xiàn)在活化的AKT 與MDM2 結(jié)合，促使MDM2 的 Ser166 和 Ser186 位點磷酸化，核內(nèi)泛素連接酶活性上調(diào)，導(dǎo)致p53 失活，阻斷了p53 促凋亡作用［18］。本研究結(jié)果顯示：經(jīng) QFG 治療后，PI3K 蛋白表達及p-AKT/AKT 均下調(diào)，說明QFG 可能通過調(diào)控PI3K/AKT 信號通絡(luò)，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，QFG 可顯著抑制裸鼠宮頸癌Caski細胞移植瘤的生長，促進瘤體組織細胞的凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT 通路活化，促進Bax/Bcl-2 升高有關(guān)。