付長龍 ，謝新宇 ，何俊君 ，邱志偉 ，鄭春松 ，葉錦霞 ，馬德尊 *

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)雜志社，福建 福州 350122）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）嚴重危害中老年人群的生命健康，關(guān)節(jié)軟骨漸進性退變是導(dǎo)致 KOA 的關(guān)鍵病因［1-2］。臨床中 KOA 患者常伴有患處關(guān)節(jié)的反復(fù)疼痛、屈伸活動不利等癥狀，病情進展至疾病后期還可出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限乃至致殘［3-4］，因此，延緩關(guān)節(jié)軟骨細胞退變，防止病情進一步發(fā)展，是治療KOA 的重要舉措。研究發(fā)現(xiàn)PERK 信號通路介導(dǎo)的軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是影響KOA 軟骨退變的重要環(huán)節(jié)之一［5-6］，但從miRNA-377-3p 調(diào)控PERK 信號通路關(guān)聯(lián)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強子（EDEM1）、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、轉(zhuǎn)錄激活子4（ATF4）、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BIP）與 DNA 損傷誘導(dǎo)基因 153（GADD 153）角度，探討榮筋拈痛方（RJNTD）延緩 KOA 軟骨細胞退變的作用機制尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 毒胡蘿卜素（TG，美國Sigma公司，批號：0000120608）；顯影超敏試劑盒（中國亞科因生物技術(shù)有限公司，批號：ATTAU1101）；EDEM1（批號：00041108）、PERK（批號：00088211）、Ⅱ型膠原組化抗體（批號：00010731）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；即用型免疫組化試劑盒（福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：1908219706C）；ATF4（批號：9N29）、BIP（批號：9N29）、GADD153（批號：4612）、GAPDH（批號：9306）均購自美國SAB 公司；通用型高靈敏度染料法定量PCR 檢測試劑盒（中國諾唯贊生物技術(shù)有限公司，批號：7E570A1）；Nano?Drope 2000 微量紫外分光光度計（賽默飛世爾科技中國有限公司）；CFX96 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；引物設(shè)計與合成：miRNA-377-3p（上游：CCGCGATCACACAAAGGCAAC，下游：AGTGC AGGGTCCGAGGTATT）、U6（上游：CTCGCTTCGGC AGCACATATACT，下游：ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC）均購自福州尚亞生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物 榮筋拈痛方凍干粉購自江陰天江藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：2006001，藥物安全性及質(zhì)量控制檢測均已完成。

1.3 實驗動物 健康SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30只，4周齡，體質(zhì)量（15±3）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。清潔級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。實驗動物按標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實驗過程及方法均符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會要求。

2 實驗方法

2.1 軟骨細胞培養(yǎng)、鑒定 小鼠經(jīng)5.0%異氟醚麻醉下處死，無菌條件下體外分離雙膝軟骨，PBS 洗滌3次，隨后經(jīng)0.2%Ⅱ型膠原酶消化獲得原代軟骨細胞。原代軟骨細胞培養(yǎng)到第9天后進行傳代培養(yǎng)，獲得一代軟骨細胞。按照前期研究基礎(chǔ)對一代軟骨細胞進行Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色鑒定［7］，在無菌玻片上用4%多聚甲醛固定細胞，加入軟骨素酶 ABC 后室溫孵育 30 min，PBS 漂洗，5 min/次，共3次，加入5% BSA 室溫孵育30 min。加入Ⅱ型膠原組化抗體反應(yīng)30 min，PBS 洗滌后在50 μL DAB 浸潤10 min；依次經(jīng)過蘇木素復(fù)染、沖洗與反藍，最后對標本進行晾干、脫水、封片和顯色拍照。觀察到細胞核出現(xiàn)藍染，其胞漿區(qū)呈現(xiàn)棕黃色，表明提取的細胞為軟骨細胞，無雜質(zhì)細胞，純度良好。

2.2 實驗分組及干預(yù)措施 將軟骨細胞以20萬/孔接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清低糖DMEM 培養(yǎng)液置于5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將細胞隨機分成空白組、對照組、模型組和中藥組，細胞匯合至80%時開始干預(yù)?？瞻捉M常規(guī)培養(yǎng)4 h，對照組常規(guī)培養(yǎng)4 h 后更換300 μg/mL RJNTD 培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，模型組用 25 μmol/L TG 培養(yǎng)液培養(yǎng) 4 h 后改為常規(guī)培養(yǎng)，中藥組用25 μmol/L TG 培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h 后更換300 μg/mL RJNTD 培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。

2.3 Real-time PCR 檢 測 miRNA-377-3p 相 對 表 達水平 各組干預(yù)后采用Trizol 法提取軟骨細胞中的總RNA；微量紫外分光光度計檢測各組樣本RNA濃度，并檢測260 nm 與280 nm 處吸光度，計算比值。采用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄miRNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：55℃ 15 min，85℃ 5 s。以 1 μL cDNA 為模板擴增miRNA-377-3p。擴增反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)。以 U6 為內(nèi)參照基因，計算各目的基因 2-??Ct，比較分析 miRNA-377-3p相對表達水平。

2.4 Western blot 檢測軟骨細胞中 EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表達水平 干預(yù)后提取各組軟骨細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白定量，配制12%分離膠和5% 濃縮膠，上樣后進行電泳，采用半干法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h 后洗膜，再將各條膜放入預(yù)先配置好的EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD 153 的一抗后，置于4 ?C 冰箱搖床過夜充分震蕩反應(yīng)，待二抗反應(yīng)處理后，使用ECL 發(fā)光液進行顯影，于凝膠成像儀下曝光成像，后分析儲存。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。計量資料符合正態(tài)分布采用（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 各組miRNA-377-3p 相對表達水平比較 見圖1。

圖1 各組miRNA-377-3p 相對表達水平比較圖

3.2 各組 EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表達水平比較 見圖2。

圖2 各組EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表達水平比較圖

4 討 論

KOA 以“膝骨痹”特征起病，其主要病機為肝腎虧虛為本，風(fēng)寒濕邪為標［8］，治當補肝腎、祛風(fēng)濕。榮筋拈痛方具有補肝腎、祛風(fēng)濕、除痹痛之功，臨床治療KOA 具有良效［9］。課題組前期研究證實：榮筋拈痛方可促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白表達，并促進軟骨細胞增殖，進而延緩軟骨細胞退變［10］。

關(guān)節(jié)軟骨漸進性退變是KOA 的關(guān)鍵病因，而關(guān)節(jié)軟骨細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS）與KOA軟骨退變密切相關(guān)［11］。研究發(fā)現(xiàn)：KOA 發(fā)生后，miRNA-377-3p 在KOA 相關(guān)組織中表達呈降低趨勢［12］，且在軟骨細胞中過表達 miR-377-3p 可促進軟骨細胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，并減輕軟骨細胞退變程度［13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，與BiP 解離的PERK 寡聚后發(fā)生磷酸化，可促進ATF4 表達，上調(diào)EDEM1 與GADD153 表達，最終促使軟骨細胞凋亡發(fā)生［14-16］。前期我們通過StarBase 數(shù)據(jù)庫檢索篩選基因結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)miR-377-3p 與EDEM1 具有結(jié)合位點。EDEM1 作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的重要基因，可促進蛋白質(zhì)降解從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［17-18］，推測miRNA-377-3p 可調(diào)控PERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且是影響KOA 軟骨退變的重要環(huán)節(jié)［19-20］。

本研究實驗結(jié)果顯示：榮筋拈痛方干預(yù)TG 誘導(dǎo)的軟骨細胞后，細胞中miR-377-3p 基因表達上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)PERK 信號通路相關(guān)蛋白EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 異常增高的蛋白表達水平下降，表明榮筋拈痛方可以有效緩解軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮延緩軟骨退變的作用，其機制可能與miR-377-3p 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白有關(guān)。