陳武進(jìn) ，黃 偉 ，陳 勇 ，陳旭征 ，4，華杭菊 ，林久茂 ，4*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；4.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

大腸癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤［1］，轉(zhuǎn)移是大腸癌治療失敗并導(dǎo)致死亡的主要因素［2-3］，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是防治腫瘤的重要策略，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是大腸癌轉(zhuǎn)移的主要因素和重要機(jī)制之一，調(diào)控EMT 對大腸癌轉(zhuǎn)移至關(guān)重要［4］。長非編碼RNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（lncRNA MALAT1）在多種腫瘤中表達(dá)異常，對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有重要調(diào)控功能［5］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1可上調(diào)TGF-β 的表達(dá)，提高EMT，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［6-9］。白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.，HDW）因其顯著的抗腫瘤作用是目前國內(nèi)外抗腫瘤研究的熱點(diǎn)中藥之一，臨床應(yīng)用研究顯示其無明顯的毒副作用［10-14］。本課題組前期研究表明HDW 可影響多條腫瘤相關(guān)信號通路，發(fā)揮抑制大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用［11，15-17］。但 HDW 對 lncRNA MALAT1 表達(dá)影響與其抑制大腸癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系尚不明確，因此，本實(shí)驗(yàn)從lncRNA MALAT1/TGF-β 通路調(diào)控EMT 角度探討HDW 抑制大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞株購于南京凱基生物科技有限公司。

1.2 藥物提取 白花蛇舌草全草用85%乙醇回流提取3次并過濾，合并提取液，濃縮至無醇味，提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)得到浸膏，然后真空干燥得到干燥粉末，即HDW 提取物。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液PBS 均購自美國Life Tech?nologies 公司；Transwell 小室、基質(zhì)膠均購自美國Corning 公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒、SYBRTM Select Master Mix 試劑均購自美國Thermo 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；SDSPAGE 配膠試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；SDS-PAGE 配膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TGF-β 抗體、Smad4 抗體、E-cad?herin 抗體、N-cadherin 抗體、Vimentin 抗體、GAPDH一抗、HRP 二抗均購自美國CST 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱均購自美國Thermo 公司；多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Life 公司）；垂直電泳槽、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+均購自美國Bio-Rad 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HDW 藥液的制備 稱取200 mg HDW 提取物溶于1 mL PBS，制備成200 mg/mL HDW 藥液，儲存于-20℃冰箱中。

2.2 SW620 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) SW620 細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%FBS、1%雙抗（含100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)用0.25%胰酶消化、傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SW620 細(xì)胞分為0 mg/mL組、0.5 mg/mL組、1 mg/mL組、2 mg/mL組。

2.3 倒置顯微鏡觀察SW620 細(xì)胞形態(tài) 取各組細(xì)胞，按2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預(yù)24 h。24 h 后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化并拍照記錄。

2.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 取各組細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預(yù) 24 h。24 h 后每孔加入含 10 μL 的CCK-8 溶液100 μL，37℃孵育2 h，于全自動酶標(biāo)儀450 nm 測定各組吸光度值（即OD 值），并按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力：

細(xì)胞活力/%＝藥物組OD 值/0 mg/L組OD 值×100%

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取各組細(xì)胞，按2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后，匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用小規(guī)格移液槍頭對6 孔板進(jìn)行劃痕，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預(yù)24 h，于0、24 h 時(shí)分別在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力 取各組細(xì)胞，按 2.5×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于 6 孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預(yù) 24 h。24 h 后吸棄各孔溶液，分別進(jìn)行消化。空白培養(yǎng)基重懸調(diào)整消化后的細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，將200 μL 細(xì)胞懸液滴加于不含基質(zhì)膠上室（遷移實(shí)驗(yàn)）和含基質(zhì)膠上室（侵襲實(shí)驗(yàn)），下室加入700 μL 完全培養(yǎng)基，放入恒溫箱培育12 h。12 h 后上室固定于4%多聚甲醛20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，超純水漂洗3次，棉簽擦拭多余液體后，倒置顯微鏡下觀察被結(jié)晶紫染色的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，并拍照。

2.7 RT-qPCR 法檢測 SW620 細(xì)胞 lncRNA MALAT1相對表達(dá)量 取各組細(xì)胞，按2.5×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后，各組分別加入 0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預(yù) 24 h。24 h 后使用Trizol 試劑提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，首先依次加入1 μg 總RNA、2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser后，加DEPC水至10 μL，42℃反應(yīng)2 min 以除去DNA；隨后再加入 4 μL 5×prime Script buffer、1 μL Mix、1 μL Mix、4 μL DEPC 水，37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng) 5 s，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)體系：5 μL Mix、2.2 μL DEPC水、2 μL cDNA、0.4 μL 上游引物、0.4 μL 下游引物，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火35 s，循環(huán)40次。通過7500 FastPCR 儀測定lncRNA MALAT1相對表達(dá)量。

2.8 Western blot 檢測 TGF-β、Smad4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，按2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW藥液干預(yù)24 h。24 h 后棄上清，用PBS 清洗，收集細(xì)胞后加入蛋白裂解液，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，取40 μg 上樣量于聚丙烯酰胺凝膠中電泳；后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；用5%脫脂奶粉對目的膜進(jìn)行封閉1 h；然后于含有0.25%Tween-20的TBST中漂洗15 min（5 min/次，共3次），最后孵育目的一抗（GAPDH、TGF-β、Smad4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin；一抗稀釋比例為1∶1 000）4℃搖床過夜。TBST 洗 3次，5 min/次；用相對應(yīng)HRP 二抗（稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 洗 3次，5 min/次。最后用 ECL 試劑顯影成像。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬于正態(tài)分布的以（）表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，非正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)比較 見圖1。圖1 顯示：隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)皺縮變圓。

圖1 各組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)比較（×100）

3.2 各組細(xì)胞活力比較 見圖2。圖2 顯示：HDW可以降低SW620細(xì)胞活力，呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

圖2 各組細(xì)胞活力比較

3.3 各組遷移能力比較 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。圖3顯示：與 0 mg/mL組比較，0.5 mg/mL組、1 mg/mL組劃痕內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較少，2 mg/mL組劃痕內(nèi)幾乎無細(xì)胞分布。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4 顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW 藥物濃度的增加，各組SW620 細(xì)胞遷移數(shù)逐漸減少。

圖4 各組Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（×200）

3.4 各組侵襲能力比較 結(jié)果見圖5。圖5 顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW 藥物濃度的增加，各組SW620 細(xì)胞侵襲數(shù)逐漸減少。

圖5 各組Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（×200）

3.5 各組lncRNA MALAT1 相對表達(dá)量比較 結(jié)果見圖6。圖6 顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW藥物濃度的增加，SW620 細(xì)胞lncRNA MALAT1 相對表達(dá)量逐漸下調(diào)（P＜0.05）。

圖6 各組lncRNA MALAT1 相對表達(dá)量比較

3.6 各組 TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)比較 見圖7、表1。結(jié)果顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW 藥物濃度的增加，SW620細(xì)胞TGF-β、Smad4、Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)逐漸增高（P＜0.05）。

表1 各組TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)比較（）

表1 各組TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)比較（）

注：與0 mg/mL組比較，1）P＜0.05。

N-cadherin 0.57±0.06 0.54±0.041）0.44±0.051）0.35±0.071）組別0 mg/mL組0.5 mg/mL組1 mg/mL組2 mg/mL組TGF-β 0.78±0.07 0.72±0.031）0.62±0.091）0.53±0.051）Smad4 0.70±0.04 0.59±0.091）0.48±0.051）0.31±0.031）Vimentin 0.61±0.03 0.50±0.081）0.43±0.081）0.37±0.051）E-cadherin 0.31±0.07 0.45±0.031）0.48±0.051）0.57±0.061）

圖7 各組TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白條帶圖

4 討 論

目前雖然外科綜合治療大腸癌有了長足發(fā)展，但是臨床大腸癌轉(zhuǎn)移急劇增多，對抗腫瘤藥物的研究也逐漸聚焦于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究通過CCK-8 檢測發(fā)現(xiàn)HDW 具有抑制大腸癌SW620 細(xì)胞活力作用，同時(shí)通過劃痕和Transwell 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著HDW 藥物濃度增加，HDW 抑制大腸癌SW620 細(xì)胞遷移、侵襲作用也逐漸增強(qiáng)。

研究顯示腫瘤轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜過程，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶增殖生長到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶要經(jīng)過漫長行程和諸多生物學(xué)應(yīng)變階段［18］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用被逐漸重視，被認(rèn)為是可能的腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，并將應(yīng)用于臨床以預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后。lncRNA MALAT1已經(jīng)被證實(shí)與包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其可上調(diào)TGF-β 的表達(dá)。活化的TGF-β 進(jìn)一步與下游轉(zhuǎn)錄因子Smad4 結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與其他轉(zhuǎn)錄因子或者輔助蛋白一起調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，使E-cadherin 表達(dá)下降，N-cadherin、Vimentin 表達(dá)增高，提高 EMT 能力，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞的的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［4，18-22］，因此，阻斷l(xiāng)ncRNA MALAT1/TGF-β 通路調(diào)控 EMT 是有效的防治腫瘤轉(zhuǎn)移的方式。本研究通過RT-qPCR 法檢測發(fā)現(xiàn)HDW 可明顯抑制lncRNA MALAT1 相對表達(dá)量，并通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)HDW 可抑制TGF-β、Smad4、Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin 蛋白表達(dá)，且都呈劑量依賴模式。結(jié)果表明 HDW 可通過 lncRNA MALAT1/TGF-β 通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT，抑制大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲，進(jìn)而抑制大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

本研究從lncRNA MALAT1/TGFβ 通路調(diào)控EMT 角度探討HDW 對大腸癌SW620 細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，為其臨床治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供科學(xué)依據(jù)。但由于人體腫瘤轉(zhuǎn)移過程受到眾多機(jī)制的復(fù)雜調(diào)控，白花蛇舌草對人結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是否涉及其他信號通路，有待進(jìn)一步研究探討。