焦松林 任建國 歐陽湖 倪顯春 田茂松 王俊麗

（貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省食品營養(yǎng)與健康工程研究中心，550025，貴州貴陽）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化學(xué)肥料的施用常被認(rèn)為是促進(jìn)作物增產(chǎn)豐收的主要途徑。但研究[1-2]證實(shí)，化學(xué)肥料使用效率通常較低，僅部分營養(yǎng)元素能被植物吸收利用，且長期多次施用（尤指氮肥、磷肥）極易使土壤 pH和可交換堿含量降低，致使土壤養(yǎng)分流失和生產(chǎn)力下降（即土壤退化）。此外，長期過度施用化學(xué)肥料產(chǎn)生的化學(xué)污染物（如硝酸鹽、一氧化二氮）還會(huì)通過遷移、轉(zhuǎn)化等途徑進(jìn)入水體和大氣等，引發(fā)一系列環(huán)境問題，嚴(yán)重危害人體健康[3]。因此，在不危及土壤資源及環(huán)境的同時(shí)，如何促進(jìn)作物增產(chǎn)是當(dāng)今農(nóng)業(yè)領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)重大難題。而植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）所具有的多重生物功能使其變得可能。研究[4]顯示，PGPR能通過生物固氮、溶解礦質(zhì)養(yǎng)分、調(diào)控嗜鐵素和生長素產(chǎn)生水平、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等多種促生效應(yīng)，替代化學(xué)肥料改善土壤肥力、促進(jìn)植物生長及加強(qiáng)病蟲害防治。近年來，PGPR在不少作物上的應(yīng)用研究多有報(bào)道。Habibi等[5]對從水稻根系分離的98種PGPR菌株促生效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，89.7%的菌株能產(chǎn)生生長素，54.0%表現(xiàn)出固氮酶活性，40%表現(xiàn)出溶磷及嗜鐵素分泌功能，通過水稻生長試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，超過 70%的接種菌株能明顯提高水稻根和苗的干重。婁義等[6]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌（Bacillus）Bs10、Ba12和Bl10能明顯促進(jìn)番茄根系生長，增加番茄土壤微生物區(qū)系優(yōu)勢菌甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）數(shù)量，降低病原真菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）在根區(qū)和根表土壤中定殖。朱忠彬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3能誘導(dǎo)增強(qiáng)煙葉過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和超氧化物歧化酶（SOD）等自身免疫防御酶活性，提高煙草抗病能力。因此，有望將PGPR應(yīng)用于當(dāng)今生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展中。

太子參（Pseudostellaria heterophylla）是一味臨床常用中藥材，富含多糖、皂苷、氨基酸、礦質(zhì)元素等多種活性成分，在免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)咳、抗疲勞、保護(hù)視網(wǎng)膜和治療糖尿病等方面都有重要的藥理作用[8-10]。近年來，隨著野生資源銳減，為滿足臨床用藥需求，人工生產(chǎn)逐漸成為主流。但人工生產(chǎn)中化肥及農(nóng)藥的長期施用會(huì)導(dǎo)致連作障礙發(fā)生，進(jìn)而影響到太子參產(chǎn)量及品質(zhì)，故探尋其他類型肥料替代或部分替代傳統(tǒng)化肥施用迫在眉睫。為此本研究利用前期從太子參根際分離的一株具有抗根腐病菌、溶無機(jī)磷及解鉀功能的芽孢桿菌KTS-1-1制備微生物肥料，并用于太子參盆栽試驗(yàn)，探討其對太子參生產(chǎn)狀況的影響?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中，單獨(dú)施用PGPR往往不能滿足植物生長對營養(yǎng)的需要[11-12]，本試驗(yàn)在促生菌 KTS-1-1的基礎(chǔ)上增施一定比例的氮磷鉀復(fù)合肥，探究不同比例氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1配施對太子參生理特性、生物量及品質(zhì)的影響，為太子參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

太子參品種為‘三泓 1號’，購自貴州省施秉縣三泓藥業(yè)有限公司。氮磷鉀復(fù)合肥（總養(yǎng)分＞48%，氮:磷:鉀=15:18:15）購自貴州開磷（集團(tuán)）有限責(zé)任公司。促生菌KTS-1-1菌株由課題前期獲取[13]，經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH 7.0～7.2）涂布培養(yǎng)后稀釋成含活菌濃度約 3×108CFU/mL的菌懸液。土壤基本理化指標(biāo)為pH 7.56、有機(jī)質(zhì)12.81g/kg、有效氮 114.92mg/kg、有效磷 12.79mg/kg、有效鉀131.64mg/kg、電導(dǎo)率0.28mS/cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)時(shí)間為2017年12月至2018年7月。采用隨機(jī)區(qū)組排列，共設(shè)6個(gè)處理（表1），每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)10盆。篩選健康、無病、大小一致的太子參塊根作為種子進(jìn)行盆栽種植（盆高40cm，直徑35cm），稱取15kg土壤，添加2.0g尿素，1.5g鈣肥，混勻后裝盆，每盆放10個(gè)太子參塊根后用5kg土壤將其覆蓋。太子參種植后期按常規(guī)管理，分別在太子參初花期、盛花期和花后期對各處理地上部追施（噴施）200mL處理液，成熟期采集太子參植株于-80℃冰箱保存待測。種植期間根據(jù)土壤狀況適當(dāng)補(bǔ)充自來水，每盆每次補(bǔ)水300mL，以保證土壤濕潤。

表1 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1(3×108 CFU/mL)施用方案設(shè)計(jì)Table 1 The scheme design on the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 (3×108 CFU/mL)

1.3 測試項(xiàng)目及方法

1.3.1 生理特性 成熟期隨機(jī)采取各處理組的太子參植株30株（每個(gè)重復(fù)10株）。蒸餾水沖洗葉片，塊根去掉塵埃、土壤顆粒，常溫自然晾干，液氮研磨后在-80℃冰箱保存待測。分別采用凱氏定氮法、鉬藍(lán)法及火焰光度法測定葉片氮、磷和鉀營養(yǎng)元素含量，采用試劑盒（南京建成生物公司）測定葉片CAT、SOD、PAL和POD防御酶活性。

1.3.2 生物量 樣品采集同1.3.1，30株植株經(jīng)蒸餾水清洗，常溫晾干后，按常規(guī)方法測定株高、塊根鮮重。采用葉面積儀（GDY-500M，江蘇連云港金升科技有限公司）測定平均葉面積。塊根在70℃烘干至恒重，測定干重。

1.3.3 塊根品質(zhì) 取適量在-80℃冰箱保存的待測塊根進(jìn)行品質(zhì)測定，參照秦民堅(jiān)等[14]的方法，采用硫酸―苯酚法測定塊根多糖含量。用香草醛―冰醋酸法測定塊根皂苷含量。采用試劑盒（南京建成生物公司）測定塊根氨基酸含量。用原子吸光光譜法[15]測定塊根鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅和鈷元素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2016和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌 KTS-1-1配施對太子參生理特性的影響

2.1.1 對葉片營養(yǎng)元素含量的影響 由圖1可看出，與CK處理相比，T1～T5處理均能不同程度地提高葉片氮、磷、鉀營養(yǎng)元素含量。與T1處理相比，T2和T3處理葉片氮含量、T5處理葉片鉀含量顯著降低，而T4處理葉片氮、磷、鉀含量分別顯著增加了12.27%、32.81%和37.80%。復(fù)合肥與促生菌配施處理（T3、T4、T5）之間，T4處理葉片氮、磷、鉀含量較其他處理有所升高，其氮、磷、鉀含量較 T3處理顯著增加了 31.35%、18.06%和36.97%，氮和鉀含量較T5處理顯著增加了11.57%和50.27%。由此可見，減量75.0%的氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1配施（T4）更有利于葉片氮、磷、鉀營養(yǎng)元素的吸收。

圖1 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參葉片營養(yǎng)元素含量的影響Fig.1 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on nutrient elements content in leaves of P.heterophylla

2.1.2 對葉片防御酶活性的影響 由圖2可知，相比T1處理，T2和T3處理CAT活性分別顯著提高了37.18%和37.37%，但與CK、T4和T5處理相比無顯著性差異（P＞0.05）。在葉片 SOD、PAL及POD活性方面，T2、T3、T4處理相比CK和T1處理均顯著提高，T2處理較 CK處理分別提高了51.24%、14.48%和3.36%，較T1處理分別提高了22.67%、27.86%和7.00%；T3處理較CK處理分別提高了24.78%、10.81%和40.89%，較T1處理分別提高了1.21%、23.76%和45.85%；T4處理較CK處理分別提高了50.20%、19.72%和40.24%，較T1處理分別提高了21.83%、33.71%和45.19%。T5處理相比T1處理，SOD和POD活性分別顯著降低了7.30%和13.86%，而PAL活性則顯著提高了6.89%，與T2、T3和T4處理相比，T5處理葉片的SOD、PAL及POD活性均顯著降低，較T2處理分別降低了24.43%、16.40%和19.50%，較T3處理分別降低了8.40%、13.64%和40.94%，較T4處理分別降低了23.91%、20.06%和40.67%。

圖2 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參葉片防御酶活性的影響Fig.2 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the activities of defense enzymes in leaves of P.heterophylla

葉片防御酶活性的聚類分析表明（圖3），6個(gè)處理大致上分為2大類，即CK、T1、T5處理為一類，T2、T3、T4處理為一類。綜上說明促生菌KTS-1-1單獨(dú)噴施（T2處理）或與減量75.0%、87.5%的氮磷鉀復(fù)合肥配施（T3和T4處理）均有利于誘導(dǎo)提高葉片防御酶活性，而單施復(fù)合肥或高劑量復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1配施（如T1和T5處理）對葉片防御酶活性大都具有抑制作用。

圖3 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參葉片防御酶活性的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the activities of defense enzymes in leaves of P.heterophylla

2.2 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌 KTS-1-1配施對太子參生物量的影響

由表2可知，與CK處理相比，T2處理在株高、平均葉面積、塊根鮮重及塊根干重方面分別顯著提高了9.26%、18.78%、22.69%和17.66%，但在塊根鮮重、干重方面的促進(jìn)效果則明顯不如推薦劑量氮磷鉀復(fù)合肥（T1處理）。與CK處理相比，復(fù)合肥與促生菌配施（T3、T4、T5處理）能在一定程度上起到促生作用，尤以T3和T4處理的促生效果最為明顯，T3處理在株高、平均葉面積、塊根鮮重及塊根干重方面分別顯著提高了13.22%、35.29%、46.25%和34.95%，T4處理分別顯著提高了10.20%、28.05%、70.62和54.95%，且T4處理相比T1處理塊根鮮、干重也分別顯著提高了7.84%和10.40%；盡管T5處理平均葉面積、塊根鮮重和塊根干重較T2處理有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，減量75.0%和87.5%的氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1配施（T3和T4處理）有助于提高塊根生物量，但高劑量復(fù)合肥配施（如T5處理）對生物量有抑制作用。

表2 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參生物量的影響Table 2 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp.KTS-1-1 bacterial suspension on the biomass of P.heterophylla

2.3 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌 KTS-1-1配施對太子參品質(zhì)的影響

2.3.1 對塊根多糖、皂苷及氨基酸含量的影響 由表3可知，相比CK處理，T1、T3和T4處理的塊根多糖和氨基酸含量均顯著提高，T1處理分別提高了24.58%和151.11%，T3處理分別提高了53.07%和62.22%，T4處理分別提高了35.38%和68.14%。T2處理在塊根多糖及皂苷含量方面與 CK處理無顯著差異（P＞0.05），但氨基酸含量顯著提高約31.10%。T5處理雖能一定程度地提高塊根多糖及氨基酸含量，但總體效果不及T3和T4處理。另外單施促生菌（T2處理）、氮磷鉀復(fù)合肥（T1處理）或復(fù)合肥與促生菌配施（T3、T4、T5處理）均對塊根皂苷含量無顯著影響。由此可見，復(fù)合肥推薦使用量（T1處理）和減量75.0%和87.5%的氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1配施處理（T3、T4處理）均有利于塊根多糖及氨基酸的形成。

表3 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1施用對塊根多糖、皂苷及氨基酸含量的影響Table 3 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the contents of polysaccharides，saponins and amino acids in the roots of P. heterophylla

2.3.2 對塊根礦質(zhì)元素含量的影響 由表4可知，所有處理的塊根鐵、錳、銅和鋅含量間均無顯著性差異（P＞0.05），但T1～T5處理鈣、鈷含量較CK處理均有顯著增加，鈣含量分別增加了 22.56%、32.22%、24.46%、29.17%和31.49%，鈷含量分別增加了15.94%、9.29%、19.84%、21.56%和26.61%。相比T2處理，T3、T4、T5處理鈷含量分別顯著提高了9.65%、11.23%和15.84%。相比CK處理，T2處理鎂含量顯著提高了9.32%，其余處理與CK處理相比鎂含量均無顯著差異（P＞0.05）。由此可見，促生菌KTS-1-1單獨(dú)噴施（T2處理）能明顯提高塊根鎂含量，所有促生菌和復(fù)合肥配施均有利于塊根對鈣、鈷元素的吸收。

表4 氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參塊根礦質(zhì)元素含量的影響Table 4 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the contents of mineral elements in the roots of P.heterophylla mg/kg

3 討論

PGPR是一類定殖于植物根際土壤的有益細(xì)菌。有研究[16-17]表明，接種PGPR能提高土壤中可吸收養(yǎng)分含量（如有效氮、有效磷），促進(jìn)植株對這些養(yǎng)分吸收利用；亦可誘導(dǎo)增強(qiáng)植物自身免疫防御酶活性，增強(qiáng)植物對逆境的抵抗[7,18]；也能提高植物光合作用速率，促進(jìn)碳氮代謝產(chǎn)物如氨基酸和多糖等物質(zhì)合成[12,19]，以及通過氧化還原作用，分泌有機(jī)酸、螯合劑及提高植酸酶活性等機(jī)制促進(jìn)植物對礦質(zhì)元素的吸收累積[20-22]，從而促進(jìn)植物生長，改善品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，促生菌處理（T2）不僅能提高太子參葉片氮、磷、鉀營養(yǎng)元素含量及葉片POD、PAL和 SOD活性，還能顯著提高太子參生物量（株高、平均葉面積及塊根鮮、干重）和促進(jìn)塊根鈣、鎂和鈷元素積累，這與短短芽孢桿菌DZQ3誘導(dǎo)增強(qiáng)煙葉POD、PAL和SOD活性[7]，芽孢桿菌DZ31提高花生植株生物量（植株鮮、干重）及氮、磷、鉀營養(yǎng)元素含量[16]，以及紅根瘤菌（Rhizobium rubi）提高西蘭花（Brassica oleraceaL.）產(chǎn)量及改善氮、磷、鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素含量[23]的研究結(jié)果類似，這或許與其具有的促生效應(yīng)（抗根腐病菌、溶無機(jī)磷及解鉀功能）有關(guān)。但在塊根品質(zhì)方面，本研究結(jié)果顯示，促生菌處理（T2）對太子參塊根多糖、皂苷、氨基酸及鐵、錳、銅、鋅元素含量的影響作用不顯著，這與解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）提高黨參[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]塊根氨基酸含量[24]，根瘤菌（Rhizobiumsp.）改善蒙古黃芪（Astragalus mongholicusBunge.）塊根總多糖及總皂苷含量[25]，以及芽孢桿菌M3和芽孢桿菌OSU-142提高蘋果（Malus domesticaL.）葉片中鐵、錳、鋅等礦質(zhì)元素含量[21]的研究結(jié)論不符。造成該差異的原因可能與研究使用的土壤性狀及PGPR的不同有關(guān)[26-27]。

另有研究[28-29]表明，在 PGPR的基礎(chǔ)上增施適量化學(xué)肥料有利于提高土壤中微生物種群密度及養(yǎng)分供應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)植物生長及品質(zhì)的改善。本研究中T4處理能明顯提高植株對土壤氮、磷和鉀的吸收，而T3、T5處理的作用效果較小，該結(jié)果與芽孢桿菌ZJM-P5配施不同水平氮、磷對紅小豆（Phaseolus angularisLinn）植株氮、磷含量影響的結(jié)論相似，即化肥配施不當(dāng)（過高或過低）會(huì)抑制植株對氮、磷營養(yǎng)元素的吸收利用[30]。張朝輝[31]的研究結(jié)果表明，與常規(guī)施用復(fù)合肥相比，PGPR與適量的化肥（較常規(guī)減施20%復(fù)合肥）配施更有利于烤煙植株對土壤氮、磷和鉀的吸收，該研究結(jié)論與本文中T4比T1處理更有利于葉片氮、磷、鉀營養(yǎng)元素吸收積累的研究結(jié)果基本相似。在促生效應(yīng)方面已有報(bào)道[19]，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）與低劑量氮磷鉀復(fù)合肥（復(fù)合肥推薦劑量的25%）配施表現(xiàn)出明顯的促生效應(yīng)，與高劑量復(fù)合肥（復(fù)合肥推薦劑量的75%和100%）配施促生效應(yīng)不顯著，這與本研究中T4處理太子參塊根生物量明顯高于T3和T5處理的結(jié)果相一致。

促生菌與化學(xué)肥料配施對植物防御酶活性和品質(zhì)的影響也因肥料的劑量不同而有所不同。芽孢桿菌ZJM-P5與不同水平氮、磷配施對紅小豆的生長試驗(yàn)[30]表明，在相同促生菌濃度下根系SOD和POD活性隨氮和磷水平增加，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。固氮螺菌（Azospirillum）和固氮菌（Azotobacter）復(fù)合菌劑與不同劑量化肥配施對向日葵（Helianthus annuusL.）產(chǎn)量及品質(zhì)試驗(yàn)[32]表明，與配施全量化肥相比，25%～50%的全量化肥配施能明顯提高果實(shí)產(chǎn)量、蛋白質(zhì)及油脂含量。Nascente等[33]研究發(fā)現(xiàn)，相比120kg/hm2氮肥供應(yīng)水平，沙雷氏菌（Serratiaspp.）BRM 32114在40和 80kg/hm2氮肥供肥水平下更有利于水稻谷粒產(chǎn)量的增加，并增加谷粒中氮、鈣、鎂等礦質(zhì)元素含量。在本研究結(jié)果中，與促生菌―高劑量復(fù)合肥配施（T5處理）相比，低、中劑量復(fù)合肥配施（T3和T4處理）更利于誘導(dǎo)提高葉片SOD、PAL和POD的活性，改善塊根品質(zhì)（多糖、氨基酸、鈣、鈷含量），這與上述研究報(bào)道對紅小豆[30]、向日葵[32]及水稻[33]的研究結(jié)論類似。

此外，Chen等[34]研究結(jié)果表明，氮肥合理供應(yīng)條件下能顯著提高小麥PAL和POD的活性，促進(jìn)木質(zhì)素等酚類產(chǎn)物合成，這與本研究中T1處理抑制PAL和POD活性的結(jié)果相反，可能與作物類型和土壤養(yǎng)分供應(yīng)差異相關(guān)。而Shin等[35]和Ková?ik等[36]的研究報(bào)道顯示，氮和磷養(yǎng)分缺乏能誘導(dǎo)激發(fā)植株防御酶基因（AtNrt2.1、AtPT2）表達(dá)上調(diào)，提高酚類產(chǎn)物代謝相關(guān)酶（如POD、PAL）活性。

4 結(jié)論

相比常規(guī)氮磷鉀復(fù)合肥處理（T1）、單施促生菌KTS-1-1處理（T2）及減量50.0%和87.5%的常規(guī)氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌 KTS-1-1配施處理（T3和T5），減量75.0%的常規(guī)氮磷鉀復(fù)合肥與促生菌KTS-1-1配施（T4）更有利于太子參生長，提高葉片中氮、磷、鉀營養(yǎng)元素含量及SOD、PAL和POD的活性，且該處理在改善塊根品質(zhì)方面（氨基酸除外）也能達(dá)到常規(guī)氮磷鉀復(fù)合肥處理（T1）的施用效果，進(jìn)而說明了該處理方案在太子參無公害栽培中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。