閆曉翠 段振盈 楊華麗 姚占軍 李在峰

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，071001，河北保定；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，071001，河北保定）

小麥葉銹病是由葉銹病菌（Puccinia tirticina）侵染引起的真菌病害，致病菌屬于活體寄生菌，主要侵染小麥葉片，但在發(fā)病嚴(yán)重或高度感病的小麥品種中，也可侵染葉鞘和穎殼[1-2]，該病害是影響世界小麥生產(chǎn)安全的主要病害之一。幾乎每年小麥主產(chǎn)區(qū)均有葉銹病的發(fā)生，20世紀(jì)中后期墨西哥西北部發(fā)生葉銹病害大流行，產(chǎn)量損失高達(dá)70%[3]，在中國(guó)華北冬麥區(qū)發(fā)生過6次（1969、1973、1975、1979、2012和2015年）葉銹病害流行，其中僅2015年產(chǎn)量損失就高達(dá)19.1萬t[4-5]。近年來，小麥葉銹病發(fā)生危害有明顯加重趨勢(shì)。雖然采用化學(xué)藥劑能短暫防治葉銹病，但培育廣譜抗病品種是行之有效的最佳方法。

小麥對(duì)葉銹病抗性分為小種?；剐裕╮ace specific resistance）和非小種?；剐裕╪on-race specific resistance）[6]。小種?；剐酝ǔＪ菍?duì)特定菌種表現(xiàn)出抗性，常發(fā)生在小麥苗期，又稱為苗期抗性，常因病原菌毒性的變異而喪失[7-8]，通過基因聚合和基因布局可以延長(zhǎng)此類抗性基因的有效性。非小種?；剐砸话銓?duì)1種病原菌的多個(gè)不同生理小種或者多種病原菌有效，一般在成株期表現(xiàn)，通常具有慢銹抗病性（slow rusting resistance）和持久抗病性（durable resistance）的特點(diǎn)[9]，多個(gè)抗性基因的聚合可能表現(xiàn)出對(duì)此類病菌完全抗病。

至今，已正式命名的抗葉銹病基因（Lr）有79個(gè)[10]，其中大部分為苗期抗病基因，僅有16個(gè)抗葉銹病基因表現(xiàn)為成株抗性（Lr12、Lr13、Lr22a、Lr22b、Lr34、Lr35、Lr37、Lr46、Lr48、Lr49、Lr67、Lr68、Lr74、Lr75、Lr77和Lr78）。其中，Lr34/Yr18/Pm38/Sr57[11]、Lr46/Yr29/Pm38/Sr58[12]和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55[13]等基因兼抗多種病害，具有一因多效及抗性持久穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、共顯性高及成本低等優(yōu)點(diǎn)，常被廣泛應(yīng)用于抗病基因的初步定位[14]。2016年，師令智等[15]利用SSR標(biāo)記在CIMMYT品系19HRWSN-76中定位出1個(gè)苗期葉銹抗病基因LrHR76；2015年，王佳真等[16]在濰麥8號(hào)中定位到1個(gè)位于2AS染色體上的成株QTL位點(diǎn)QLr.hbau-2AS。

小麥品種周麥22（國(guó)審麥2007007）是河南省周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的優(yōu)良品種，該品種為半冬性品種，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、農(nóng)藝性狀優(yōu)良及抗病性好等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)黃淮冬麥區(qū)南部得到了大面積推廣和應(yīng)用。至2019年周麥22累計(jì)種植面積達(dá)670萬hm2，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的原因之一是對(duì)小麥葉銹病[17]和條銹病[18]均表現(xiàn)出良好的抗性。Wang等[17]對(duì)周麥22進(jìn)行了苗期抗葉銹病研究，定位到1個(gè)苗期抗葉銹病基因LrZH22。為了明確其所攜帶的成株抗葉銹基因，本研究利用周麥22/銘賢169及其255個(gè)F2:3家系，對(duì)其進(jìn)行成株期抗葉銹病QTL分析，并結(jié)合已有的研究結(jié)果進(jìn)行比較，挖掘周麥22中抗小麥葉銹病的新QTL位點(diǎn)，并找到與QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記以應(yīng)用于輔助選擇育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗病親本為周麥22，系譜：周麥12（周8425A/SW73295）/溫 6//周麥 13（周 8425B/周麥 9 號(hào)），感病親本銘賢 169及其雜交、自交獲得的 255個(gè)F2:3家系群體；感病對(duì)照品種為鄭州5389，也作為葉銹菌的擴(kuò)繁材料。于小麥成株期接種3個(gè)葉銹菌生理小種FHRT、THTT和THJT的混合菌種。小種的命名采用Long等[19]的四字母命名法。所有供試材料和葉銹菌種均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院小麥銹病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 成株期接種和侵染型調(diào)查

于2014-2015和2015-2016年度將抗病親本周麥22、感病親本銘賢169及其255個(gè)F2:3代群體分別播種于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)（河北保定）試驗(yàn)地。田間種植方式為行距25cm，行長(zhǎng)1.5m，每行25粒，每9行加種1份感病品種鄭州5389作為發(fā)病對(duì)照。適當(dāng)澆水、施肥和田間除草。

在小麥拔節(jié)期采用噴霧法進(jìn)行田間接種，接種日期通常為4月下旬的16:00，確保土壤有一定濕度。若土壤太旱，需在接菌前2d進(jìn)行灌溉，避免接菌時(shí)濕度不夠而影響接種質(zhì)量。當(dāng)感病對(duì)照鄭州5389病斑占葉片的表面積達(dá)100%時(shí)進(jìn)行田間成株表型鑒定，即最終病害嚴(yán)重度（final disease severity，F(xiàn)DS）。其接菌流程與田間病害表型鑒定參考Li等[20]的方法。

1.3 DNA提取及分子標(biāo)記篩選

利用CTAB法[21]提取抗病親本周麥22、感病親本銘賢169及其F2:3代家系小麥葉片全基因組DNA，其中每份材料分別選取3～5株進(jìn)行DNA混合提取，并分別用 1×TE稀釋成 40～50ng/μL工作液，作為大群體的篩選。此外，參照Hao等[22]提出的優(yōu)選小群體（PSG）策略構(gòu)建抗感小群體，結(jié)合田間FDS從中選取5個(gè)抗?。‵DS 5%以下）和5個(gè)感?。‵DS盡量選最大，接近 100%）的家系植株，分別提取葉片全基因組DNA作為抗感小群體。利用分布在所有小麥染色體組的1005對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)周麥22、銘賢169及抗感小群體進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記篩選。所需的PCR擴(kuò)增體系、反應(yīng)程序和PCR檢測(cè)參考王佳真等[23]的方法。

1.4 遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位

以多態(tài)性SSR分子標(biāo)記篩選抗感親本及其255個(gè)F2:3家系，將田間成株葉銹病FDS與篩選的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。利用 Excel軟件分析田間成株期葉銹病表型的分布，采用QTL Cartographer軟件進(jìn)行遺傳定位分析，其LOD值設(shè)為2.5，分析有效的QTL位點(diǎn)貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)等遺傳信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 周麥 22/銘賢 169 F2:3群體成株期葉銹病抗性表型分

依據(jù) FDS分析可知，感葉銹病對(duì)照品種鄭州5389在2個(gè)年度的FDS分別為90%和100%，表明在每個(gè)環(huán)境中抗病親本周麥 22/感病親本銘賢 169 F2:3群體的葉銹病發(fā)病良好。其抗病親本周麥22的FDS在5%左右，感病親本銘賢169的FDS在80%以上，255個(gè)家系的葉片病斑面積呈1%～100%的連續(xù)性分布，說明該群體呈現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳特性（圖1）。

圖1 周麥22/銘賢169 F2:3葉銹病最終嚴(yán)重度的頻率分布Fig.1 Frequency distributions of the FDS of Zhoumai 22×Mingxian 169 F2:3 lines for leaf rust

此外，由表1可知，在2個(gè)年度中抗病親本周麥22和感病親本銘賢169的平均FDS分別為5%和85%，且在其群體中的平均FDS為30.5%～30.9%。同時(shí)，對(duì)2個(gè)年度中葉銹病FDS的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，其呈現(xiàn)出顯著相關(guān)（P＜0.001），葉銹病FDS的相關(guān)系數(shù)（r）為0.95。

表1 周麥22/銘賢169 F2:3 255個(gè)群體在2個(gè)年度中的FDSTable 1 FDS for leaf rust of 255 F2:3 from Zhoumai 22×Mingxian 169 in two years

2.2 葉銹病成株期抗性QTL分析

利用分布于小麥染色體上的現(xiàn)存 1005對(duì) SSR引物進(jìn)行親本多態(tài)性篩選，獲得304對(duì)多態(tài)性SSR引物。將這些多態(tài)性標(biāo)記應(yīng)用于抗感小群體的篩選，獲得交換值低于30%的55對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記（表2），并用其對(duì)周麥22/銘賢169的255個(gè)F2:3家系進(jìn)行多態(tài)性篩選獲得基因型。再結(jié)合2個(gè)年度的FDS結(jié)果，在群體中檢測(cè)到2個(gè)成株抗性QTL，暫將其命名為QLr.hbau-1BL和QLr.hbau-2BS（表3和圖2）。2個(gè)成株抗性QTL均來自抗性親本周麥22，且這2個(gè)QTL均在2個(gè)年度中穩(wěn)定被檢測(cè)到（圖2）。

表2 55對(duì)SSR標(biāo)記信息Table 2 Information of 55 SSR markers

續(xù)表2 Table 2 (continued)

表3 周麥22/銘賢169 255個(gè)F2:3家系的葉銹病FDS的QTLTable 3 QTL for FDS to leaf rust in 255 F2:3 lines from Zhoumai 22/Mingxian 169

圖2 位于1BL和2BS染色體上連續(xù)2年成株抗葉銹病Fig.2 Leaf rust adult-plant resistance QTL on chromosomes 1BL and 2BS in two years

由表3可知，第1個(gè)QTLQLr.hbau-1BL的側(cè)翼標(biāo)記為Xwmc31和Xwmc631，分別解釋了2014-2015和 2015-2016年度表型變異為 9.62%和11.88%，加性效應(yīng)分別為10.17%和14.56%。第2個(gè)QTLQLr.hbau-2BS側(cè)翼標(biāo)記Xgwm374和Xbarc55位于2BS染色體上，在2014-2015和2015-2016年度中均能檢測(cè)到，分別解釋了20.99%和16.89%的表型變異，其加性效應(yīng)分別為14.09%和16.50%。結(jié)果表明，抗病品種周麥22中至少存在2個(gè)穩(wěn)定有效的QTL，且表現(xiàn)出較高的抗性。因此，鑒定的QTL可作為抗葉銹病品種的親本。同時(shí)，這些位點(diǎn)和它們緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)于基因精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助選擇有重要作用。

3 討論

本研究共檢測(cè)到2個(gè)抗葉銹病QTL分別是QLr.hbau-1BL和QLr.hbau-2BS。QTL解釋的總表型變異在葉銹病環(huán)境中為 9.62%～20.99%，證明它們對(duì)減輕病害嚴(yán)重程度的顯著作用。目前，位于1B染色體上的基因或QTL有Lr46/Yr29[24]、QLr.caas-1BL[25]、QLr.pser-1BL[26]、QLr.hbu-1BL.2[27]及本研究中的QLr.hbau-1BL，根據(jù)它們的連鎖或側(cè)翼標(biāo)記csLv46g22、Xwmc59-Xbarc213、Xwmc631-Xgwm268、Xbarc80-Xwmc728和Xwmc31-Xwmc631，確定其物理位置依次為670.2、667.2、637.2、685.1-686.7和610.35Mb?？芍狙芯恐械腝Lr.hbau-1BL位點(diǎn)可能為新的成株抗葉銹位點(diǎn)。但由于標(biāo)記區(qū)間較寬，還需要對(duì)圖譜進(jìn)行加密和進(jìn)一步檢驗(yàn)。對(duì)本研究中的第2個(gè)位于2B染色體上的抗病QTLQLr.hbau-2BS進(jìn)行分析，有5個(gè)已知的抗葉銹病基因定位于小麥 2BS染色體上，分別為L(zhǎng)r13[28]、Lr16[29]、Lr23[30]、Lr73[31]和LrZH22[17]。Wang 等[17]在周麥 22中定位了苗期抗葉銹病基因LrZH22，與本研究中QLr.hbau-2BS位置一致，均位于緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xbarc55和Xgwm374之間，抗性由已知抗葉銹病基因LrZH22提供，其抗病QTL均來自同一親本周麥22。

周 8425B作為河南省骨干親本廣泛應(yīng)用于我國(guó)小麥育種中。Zhang等[32]研究表明，LrZH22來源于周8425B的姊妹系周8425A，且具有全生育期抗性。Zhang等[33]對(duì)部分周麥系列品種進(jìn)行了抗性鑒定和標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)攜帶抗病基因LrZH22的品種在田間均表現(xiàn)很好的抗葉銹性，目前已知攜帶LrZH22的周麥系列品種有周8425B、周麥11、周麥18、周麥22、周麥28和周麥30等。因此目前我國(guó)有效抗葉銹病基因?yàn)榭谷~銹病基因LrZH22，抗性穩(wěn)定，在不同抗性群體中的貢獻(xiàn)率均很顯著，有利于小麥抗葉銹病基因育種的研究。小麥品種中國(guó)春完整基因組序列公示將會(huì)極大促進(jìn)小麥抗葉銹病基因的定位和克隆。同時(shí)根據(jù)中國(guó)春參考序列，可開發(fā)出緊密連鎖或共分離分子標(biāo)記，從而對(duì)定位的抗病基因進(jìn)行精細(xì)定位，并用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

本研究中在周麥22中定位了2個(gè)抗葉銹病位點(diǎn)，可能還含有其他抗病位點(diǎn)，有待下一步研究。同時(shí)，本研究中找到的與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可用于對(duì)抗病基因品種的篩選。

4 結(jié)論

在周麥22/銘賢169的255個(gè)F2:3家系群體中定位出2個(gè)抗病QTL，為QLr.hebau-1BL和QLr.hebau-2BS，分別解釋9.62%～11.88%和16.89%～20.99%的表型變異。其中QLr.hebau-1BL可能為1個(gè)新的成株抗病位點(diǎn)，而QLr.hebau-2BS可能為全生育期抗病基因LrZH22。這2個(gè)抗病位點(diǎn)在2個(gè)年度中均表現(xiàn)出良好的抗性，為今后進(jìn)一步基因挖掘及分子標(biāo)記輔助選擇育種提供良好基礎(chǔ)。