盧 平 康慶芳 趙孟瑤 張鳳潔 武強(qiáng)強(qiáng)馬芳芳 王宇珅 韓淵懷 王興春 李雪垠

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，030801，山西晉中；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，030801，山西晉中）

谷子（Setaria italica）屬單子葉禾本科二倍體植物（2n=2x=18），是我國重要的雜糧作物之一。谷子起源于中國，有悠久的栽培歷史，具有耐旱和耐貧瘠的特性，是發(fā)掘抗旱基因和研究作物抗旱分子機(jī)制的優(yōu)異種質(zhì)資源[1]。在擬南芥和水稻中都沒有發(fā)現(xiàn) C4光合作用等重要過程，因此需要新的模式物種[2]。谷子是C4植物，具有生長能力強(qiáng)、CO2利用率高和耐旱等優(yōu)點(diǎn)，并且具有C4途徑。谷子具有二倍體基因組小、自花授粉和種子產(chǎn)量多等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)谷子突變體xiaomi的發(fā)現(xiàn)也解決了谷子生長周期較長和植株較大等不適合作為模式生物研究的問題[3]。并且隨著谷子基因組測序的完成，谷子也逐漸成為一種模式植物[4-5]。

miRNA是一類小RNA（sRNA），是由內(nèi)源基因編碼、長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA廣泛參與動(dòng)植物基因轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，通過與靶 mRNA的靶位點(diǎn)結(jié)合抑制基因表達(dá)。在植物中，miRNA參與器官建成、生長發(fā)育、開花與育性轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸和抗逆響應(yīng)等多個(gè)生理生化過程[6-7]。雖然植物miRNA生物發(fā)生、降解、功能及調(diào)控機(jī)制已得到了較清晰的闡述，但目前關(guān)于植物miRNA作用機(jī)制的認(rèn)知仍處于初級(jí)階段[8]。谷子抗旱性突出，是研究作物耐旱性的理想模型系統(tǒng)，在干旱脅迫下，14個(gè)miRNA被上調(diào)，4個(gè)miRNA被下調(diào)。此外，已鑒定出72個(gè)潛在的新miRNA，其中3個(gè)在干旱條件下差異表達(dá)[9]。miR169是植物中較大的miRNA家族，miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase（http://www.mirbase.org/）已收錄擬南芥、水稻、玉米、大豆、番茄、油菜、大豆、玉米和山核桃等35個(gè)物種的400多個(gè)miR169基因，這些基因在植物的生長發(fā)育及非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控過程中起重要作用。擬南芥miR169家族在脅迫誘導(dǎo)植物開花中起關(guān)鍵作用，miR169d在擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致提前開花[10]；水稻miR169基因與鹽脅迫應(yīng)答和干旱誘導(dǎo)相關(guān)，還負(fù)調(diào)控水稻對稻瘟病菌的免疫[11-12]；玉米zma-miR169/ZmNFYA14參與根發(fā)育和鹽脅迫應(yīng)答[13]；大豆miR169基因參與鹽堿和干旱等非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[14-15]；番茄miR169基因能響應(yīng)致病疫霉菌的侵染[16]；油菜miR169d基因可能通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而參與油菜的早花發(fā)育[17]；楊樹miR169基因家族的靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、抗病蛋白和泛素連接酶基因等，說明其廣泛參與楊樹多種生命活動(dòng)的調(diào)控[18]；葡萄miR169的靶基因主要是 NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因[19]，是葡萄生長發(fā)育過程中抗逆境脅迫響應(yīng)的主要調(diào)控因子；山核桃miR169通過作用其下游基因調(diào)節(jié)花的發(fā)育。由于對miR169尚缺乏系統(tǒng)研究，至今僅有部分植物miR169家族成員的功能被解析。

NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因是miR169的主要靶基因。NF-Y是真核生物中一類廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異性結(jié)合順式作用元件CCAAT-box，進(jìn)而對其下游靶基因進(jìn)行正向或負(fù)向調(diào)控[20]。NF-Y作為保守的轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育和對逆境脅迫響應(yīng)中扮演著重要的角色[21]。NF-Y是1個(gè)三聚體轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-YA、NF-YB和NF-YC 3個(gè)亞基。NF-YA作為三聚體最為重要的組成因子，在N端富含色氨酸或蘇氨酸，有2個(gè)保守域NF-YB/NF-YC結(jié)合域和DNA結(jié)合域[22]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，在一些NF-YA基因的3′UTR存在miR169的切割靶位點(diǎn)，miR169可以調(diào)控NF-YA基因。擬南芥ath-miR169/NF-YA5調(diào)控模塊可以響應(yīng)干旱，miR169表達(dá)受到抑制，NFYA5基因也就脫離了miR169的控制而上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而使植物抗旱性增強(qiáng)[23]。

miR169家族在植物中主要參與非生物脅迫應(yīng)答調(diào)控，還能誘導(dǎo)植物提前開花等。目前關(guān)于谷子miR169（sit-miR169）的相關(guān)研究較少。鑒定sitmiR169家族是解析miR169參與谷子生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)機(jī)制的重要基礎(chǔ)。本文利用生物信息學(xué)方法對sit-miR169家族的染色體分布、系統(tǒng)進(jìn)化、堿基保守性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和sit-miR169及其靶基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究谷子miR169家族的進(jìn)化和功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 谷子miR169家族的染色體定位分析

從 PmiREN[24]數(shù)據(jù)庫（http://www.pmiren.com/）下載谷子sit-miR169家族成員的前體序列、成熟序列及染色體定位信息。利用TBtools[25]軟件繪制sitmiR169家族基因的染色體定位圖。

1.2 谷子miR169家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ClustalX 2.1對谷子sit-miR169前體序列進(jìn)行多序列比對；從PmiREN數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥miR169的前體序列，對谷子、水稻和擬南芥miR169的前體序列進(jìn)行多序列比對。利用MEGA X和鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1000。

1.3 谷子miR169序列堿基保守性分析

利用WebLogo 3[26]（http://weblogo. threeplusone.com/create.cgi）分析sit-miR169前體序列和成熟序列的堿基保守性。

1.4 谷子miR169前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用 RNAfold（http://rna. tbi. univie.ac.at./cgibin/RNAfold.cgi）在線預(yù)測sit-miR169前體二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，用折疊算法和基本選項(xiàng)選擇最小自由能（MFE）和配分函數(shù)。

1.5 谷子miR169組織特異性表達(dá)分析

從PmiREN數(shù)據(jù)庫下載谷子sit-miR169家族成員在根、葉和花中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用TBtools將sit-miR169的表達(dá)數(shù)據(jù)繪制成熱圖。

1.6 谷子miR169靶基因預(yù)測

利用psRNATarget[27]（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）預(yù)測靶基因。以自帶 cDNA文庫Setaria italica（foxtail millet）、transcript、JGl genomic project、Phytozome 13、312 v 2.2為搜索數(shù)據(jù)源預(yù)測sit-miR169靶基因，得分模式使用Schema V1（2011 release），Expectation≤3，UPE≤25。將預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行整理，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對候選靶基因進(jìn)行功能注釋。

1.7 谷子miR169靶基因的組織特異性和環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載上述候選靶基因在不同組織和條件下的表達(dá)量數(shù)據(jù)，并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子miR169家族基因基本信息及染色體分布

根據(jù)PmiREN數(shù)據(jù)庫，谷子基因組共有15個(gè)sitmiR169家族成員（表1）。sit-miR169k和sit-miR169o成熟序列堿基數(shù)為20，其余13個(gè)sit-miR169成熟序列堿基數(shù)均為21。15個(gè)sit-MIR169分布在除5和9號(hào)染色體外的7條染色體上（圖1），其中位于6號(hào)染色體上的sit-miR169最多（5個(gè)）。

表1 sit-miR169家族成員的基本信息Table 1 Basic information of sit-miR169 family members

圖1 sit-MIR169基因的染色體定位Fig.1 Chromosome location of sit-MIR169 genes

2.2 谷子miR169家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

sit-miR169前體序列（sit-MIR169）系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2）顯示，sit-miR169家族大致可以分為 2簇，sit-MIR169a、sit-MIR169e、sit-MIR169f和sit-MIR169j聚為一簇，其余11個(gè)sit-MIR169聚為另一簇。親緣關(guān)系較近的sit-MIR169c和sit-MIR169d位于6號(hào)染色體的相鄰位置，sit-MIR169h和sit-MIR169i位于2號(hào)染色體的相鄰位置，因此它們可能產(chǎn)生于串聯(lián)復(fù)制。然而親緣關(guān)系較近的sit-MIR169a和sit-MIR169e基因并沒有位于同一染色體，說明它們不是通過串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生。

圖2 sit-miR169家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of sit-miR169 family

對谷子、水稻和擬南芥的miR169家族成員的前體序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）顯示，谷子、水稻和擬南芥的miR169親緣關(guān)系較近，尤其是谷子和水稻的部分miR169親緣關(guān)系很近，例如sit-MIR169b/osa-MIR169b和sit-MIR169e/osa-MIR169c等。

圖3 谷子、水稻和擬南芥miR169家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the miR169 family in foxtail millet, rice and Arabidopsis

2.3 谷子miR169序列堿基保守性

sit-miR169前體序列和成熟序列的堿基保守性如圖4所示。15個(gè)sit-MIR169前體序列堿基數(shù)在88～149，前體序列1-21和104-123位點(diǎn)的堿基保守性較高，其他位點(diǎn)的保守性較低。成熟體基本產(chǎn)生于前體序列中保守性較高的1-21位點(diǎn)。除sit-miR169k和sit-miR169o成熟序列堿基數(shù)為20外，其余13個(gè)sit-miR169成熟序列堿基數(shù)均為21。15個(gè)sit-miR169成熟體中17個(gè)堿基完全保守，只有3個(gè)堿基保守性略低，說明谷子miR169在進(jìn)化過程中保守性很強(qiáng)。星標(biāo)序列中第15位堿基完全保守，第11位比較保守，其他位點(diǎn)的堿基保守性較差。

圖4 sit-miR169序列堿基保守性Fig.4 Base conservativeness of sit-miR169 sequences

2.4 谷子miR169前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

sit-miR169a前體sit-MIR169二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，15個(gè)sit-MIR169均可形成較為穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且成熟體均產(chǎn)生于前體的5′端臂上，保守性較強(qiáng)。

圖5 sit-MIR169的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary stem-loop structure of sit-MIR169

2.5 谷子miR169組織表達(dá)特異性

由圖6可知，sit-miR169g、sit-miR169h、sitmiR169i、sit-miR169j、sit-miR169k、sit-miR169l、sitmiR169m、sit-miR169n和sit-miR169o主要在谷子根部表達(dá)，sit-miR169a、sit-miR169b、sit-miR169c、sit-miR169d和sit-miR169e在葉和根中表達(dá)量較高，sit-miR169f在花中優(yōu)勢表達(dá)。結(jié)果表明，sit-miR169廣泛參與谷子各器官和組織的生長發(fā)育。

圖6 sit-miR169在不同組織中的表達(dá)情況Fig.6 Expression of sit-miR169 in different tissues

2.6 谷子miR169靶基因預(yù)測

靶基因預(yù)測（表2）顯示，谷子miR169靶基因編碼的蛋白質(zhì)大多是 NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，除此之外，還有L型凝集素類受體蛋白激酶、ω-6脂肪酸去飽和酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sec1a、SDG40蛋白、環(huán)指跨膜蛋白和核糖體大亞基假尿苷合酶SVR1。NF-Y是一類結(jié)合CCAAT-box的重要轉(zhuǎn)錄因子，包括3個(gè)亞基NF-YA、NF-YB和NF-YC。所有sitmiR169的靶基因都有NF-YA，說明NF-YA亞基基因是sit-miR169最主要的靶基因。谷子miR169靶基因中的NF-YA家族成員有NF-YA1、NF-YA4、NFYA5、NF-YA7和NF-YA10。

表2 谷子miR169靶基因預(yù)測Table 2 Prediction of miR169 target genes in foxtail millet

2.7 谷子miR169靶基因的組織特異性和環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)分析

miR169通過調(diào)控靶基因，尤其是NF-YA的表達(dá)量來影響植物的生長發(fā)育和對環(huán)境的應(yīng)答。谷子miR169靶基因NF-YA主要在根和穗中表達(dá)（圖7），表現(xiàn)出明顯的組織表達(dá)特異性，表明其可能主要參與調(diào)控谷子根和穗部的生長發(fā)育。Seita.2G037100和Seita.2G383900在穗中優(yōu)勢表達(dá)，其蛋白質(zhì)序列相似度為52%，推測這2個(gè)基因可能是產(chǎn)生于串聯(lián)復(fù)制的同源基因，其編碼的 NF-YA轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似功能。

圖7 sit-miR169靶基因在不同組織和環(huán)境誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況Fig. 7 Expression of sit-miR169 target genes in different tissues and environment conditions

基因表達(dá)數(shù)據(jù)（圖7）表明，sit-miR169靶基因的表達(dá)受環(huán)境誘導(dǎo)，例如Seita.1G338100、Seita.3G390000、Seita.9G129400、Seita.9G367200和Seita.9G521100基因在根中都有較高表達(dá)，但在不同環(huán)境誘導(dǎo)條件下的根中表達(dá)量表現(xiàn)出顯著差異。根中Seita.1G338100表達(dá)量在光照處理下最高，在氨或硝酸鹽處理下次之，在尿素處理下最低；而Seita.3G390000在尿素處理下最高，在氨或硝酸鹽處理下次之。Seita.9G521100在光照、尿素、氨或硝酸鹽處理下根中表達(dá)量差異不顯著，但在干旱條件下根中表達(dá)量較高，說明干旱能誘導(dǎo)其在根中穗的表達(dá)。

3 討論

谷子是我國古老的傳統(tǒng)抗旱、耐貧瘠作物。目前全球水資源缺乏，化肥施用過度，谷子在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展中的重要作用日益突顯。小米具有保健功能，受到越來越多的關(guān)注，谷子研究和小米產(chǎn)業(yè)迎來新的機(jī)遇。microRNA是一小段非編碼單鏈RNA，參與復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控，控制著植物的發(fā)育程序，并參與生物和非生物脅迫應(yīng)答過程。miR169是植物中較為龐大和保守的miRNA家族之一。miR169在一些植物中的功能已經(jīng)得到初步的研究，其能廣泛參與植物的逆境脅迫響應(yīng)（如鹽堿、干旱脅迫及致病疫霉菌侵染）和生長發(fā)育調(diào)控（如開花調(diào)控、花和根發(fā)育）[10-19]。谷子miR169的靶基因大多是NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因，miR169通過調(diào)控靶基因，尤其是NF-YA的表達(dá)量影響植物的生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)。鑒定并分析miR169家族對解析miR169家族成員在植物生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中的功能具有重要意義[28]。

本研究表明，谷子基因組共有15個(gè)sit-miR169家族成員，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，sit-miR169大致分為2簇，部分sit-MIR169成員可能產(chǎn)生于串聯(lián)復(fù)制（如sit-MIR169c和sit-MIR169d、sit-MIR169h和sit-MIR169i）。sit-miR169成熟序列堿基保守性很高，星標(biāo)序列堿基保守性較低。sit-miR169家族成員均能形成較穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟序列位于 5′端。sit-miR169廣泛參與谷子各個(gè)器官和組織的生長發(fā)育。sit-miR169靶基因包括NF-YA轉(zhuǎn)錄因子、L型凝集素類受體蛋白激酶、ω-6脂肪酸去飽和酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sec1a、SDG40蛋白、環(huán)指跨膜蛋白和假尿苷合酶 SVR1基因等，其中最主要的是NF-YA基因。sit-miR169k和sit-miR169o分別位于3和8號(hào)染色體，在sit-miR169家族成員中只有sitmiR169k和sit-miR169o的成熟序列堿基數(shù)目是20，并且成熟序列完全相同。sit-miR169k和sit-miR169o的靶基因有環(huán)指跨膜蛋白、假尿苷合酶SVR1和ω-6脂肪酸去飽和酶基因，與其他sit-miR169家族成員截然不同，這表明二者同源性較高，可能具有相同功能。谷子NF-YA基因主要在根和穗中表達(dá)，表現(xiàn)出明顯的組織表達(dá)特異性。Seita.2G037100和Seita.2G383900在穗中優(yōu)勢表達(dá)，其蛋白質(zhì)序列相似度為52%，推測二者可能是產(chǎn)生于串聯(lián)復(fù)制的同源基因，其編碼的 NF-YA轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似功能。sit-miR169靶基因的表達(dá)受環(huán)境誘導(dǎo)，如干旱條件能進(jìn)一步誘導(dǎo)Seita.9G521100基因在根中的表達(dá)。

谷子和水稻同為單子葉禾本科二倍體作物，在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系[4]，遺傳圖譜比較顯示，谷子與水稻的基因組序列有很高的保守性[29]。本文對谷子、水稻和擬南芥miR169進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，谷子和水稻的部分miR169親緣關(guān)系很近，例如sit-MIR169b/osa-MIR169b和sit-MIR169e/osa-MIR169c等。在水稻中，miR169與鹽脅迫應(yīng)答、干旱誘導(dǎo)相關(guān)，參與負(fù)調(diào)控水稻對稻瘟病菌的免疫[11-12]。例如osa-miR169g是osa-miR169家族中唯一能被干旱誘導(dǎo)的成員，它的啟動(dòng)子上游區(qū)域有2個(gè)相鄰的DRE（干旱響應(yīng)元件），表明其可能直接受 CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，在水稻干旱響應(yīng)中扮演重要角色[12]。谷子抗旱性和節(jié)水性突出，是研究抗旱調(diào)控機(jī)制的重要作物，然而與水稻、玉米等其他禾本科作物相比，谷子抗逆研究較為滯后，模式植物水稻miR169的研究可以為谷子提供很好的思路。

miR169與靶基因共同調(diào)控植物生長發(fā)育的各個(gè)方面，miR169與靶基因調(diào)控模塊研究為miRNA功能分析提供了思路。例如miR169/NF-YA調(diào)控模塊對植物的發(fā)育和逆境響應(yīng)起著重要作用，miR169/NF-YA參與逆境誘導(dǎo)早花調(diào)控[30]。部分sit-miR169及其靶基因的組織表達(dá)部位具有一致性，sitmiR169a、sit-miR169b、sit-miR169c、sit-miR169d和sit-miR169e主要在葉片中表達(dá)，它們親緣關(guān)系較近。它們的主要靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)蛋白、NF-YA轉(zhuǎn)錄因子和L型凝集素類受體蛋白激酶基因，其中L型凝集素類受體蛋白激酶基因主要在葉片中表達(dá)，這與sit-miR169a-sit-miR169e的組織表達(dá)部位一致，因此sit-miR169a-sit-miR169e可能參與葉片中L型凝集素類受體蛋白激酶基因的表達(dá)調(diào)控。sit-miR169f在花中優(yōu)勢表達(dá)，其靶基因Seita.2G037100（NF-YA10-1）和Seita.2G383900（NF-YA4-1）在穗中優(yōu)勢表達(dá)，因此sit-miR169f與Seita.2G037100、Seita.2G383900可能共同參與花發(fā)育調(diào)控。此外，所有sit-miR169靶基因都有NF-YA基因，NF-YA主要在根和穗部中表達(dá)，因此sit-miR169與NF-YA可能共同參與谷子根和穗部發(fā)育調(diào)控。除NF-YA基因外，miR169的靶基因還包括ω-6脂肪酸去飽和酶基因，植物脂肪酸組成很大程度上受到脂肪酸去飽和酶種類和數(shù)量的調(diào)控，深入了解脂肪酸去飽和酶的種類、數(shù)量及其編碼基因?qū)τ诙ㄏ蚋淖冎参锏闹舅峤M成具有重要的理論和實(shí)際意義[31]，這些靶基因的研究為miR169作用機(jī)制分析奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在谷子全基因組水平上鑒定了15個(gè)sit-miR169，sit-MIR169前體進(jìn)化樹大致分為2簇，其中部分sitmiR169與水稻的miR169親緣關(guān)系較近。sit-miR169家族成員的成熟序列堿基保守性高，星標(biāo)序列堿基保守性較低。15個(gè)sit-MIR169均可形成較為穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟體產(chǎn)生于5′端。

sit-miR169廣泛參與谷子各組織的生長發(fā)育。谷子miR169靶基因有NF-YA轉(zhuǎn)錄因子、L型凝集素類受體蛋白激酶、ω-6脂肪酸去飽和酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sec1a、SDG40蛋白、環(huán)指跨膜蛋白和核糖體大亞基假尿苷合酶SVR1的基因，其中NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因最多。谷子NF-YA基因主要在根和穗中表達(dá)。