楊帆 聞人可馨

摘要 偽狂犬病是制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的二類(lèi)動(dòng)物疫病，嚴(yán)重影響了國(guó)內(nèi)豬肉食品安全和市場(chǎng)價(jià)格穩(wěn)定。長(zhǎng)期以來(lái)，疫苗接種一直是防控本病的重要手段。本文主要介紹了豬偽狂犬病疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀，以期助力實(shí)現(xiàn)該病的凈化，促進(jìn)養(yǎng)殖行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

關(guān)鍵詞 豬;偽狂犬病;疫苗;研制進(jìn)展

偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的，以豬、牛、羊等為主的多種動(dòng)物出現(xiàn)呼吸、消化、神經(jīng)和生殖系統(tǒng)癥狀的急性、 高致病性傳染病。主要表現(xiàn)為種豬不育，哺乳仔豬死亡，妊娠母豬流產(chǎn)以及 2 月齡以上的豬隱性感染等。2011 年以來(lái)，新型 PRV 變 異株造成的 PR 疫情在我國(guó)多地呈流行態(tài)勢(shì)，對(duì)集約化養(yǎng)豬企業(yè)沖 擊巨大，傳統(tǒng) PR 疫苗的保護(hù)效力受到質(zhì)疑。大批科研人員積極開(kāi)拓研發(fā)路徑，不同種類(lèi)的 PR 疫苗先后問(wèn)世。本文就當(dāng)前各類(lèi) PR疫苗做簡(jiǎn)單綜述。

1 滅活疫苗

PR 滅活疫苗是把從發(fā)生典型 PR 病變的敏感細(xì)胞中提取的 PRV，用理化方法滅活，并添加合適的佐劑所制備成的死疫苗。 2001 年，國(guó)內(nèi)首支全病毒油乳劑滅活疫苗由陳煥春等成功研制， 主要原理是應(yīng)用 PRV 分離 Ea 株。臨床試驗(yàn)證明其免疫能力較好，對(duì)母豬、新生仔豬以及斷奶仔豬均有較強(qiáng)保護(hù)力。其中，對(duì)斷奶仔豬的保護(hù)率為 100%。

滅活疫苗的安全性好，研制周期較短，儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本低。雖 然免疫效果不如活疫苗，但基本滿足了未受到 PRV 污染的養(yǎng)豬場(chǎng) 的預(yù)防需要。

2 弱毒疫苗

PR 弱毒疫苗是將分離出的野毒株接種于細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，在高 溫和致突變劑的作用下反復(fù)傳代，或者通過(guò)雞胚等非豬源細(xì)胞傳 代減毒制成的活疫苗。該疫苗免疫原性良好，免疫期長(zhǎng)，對(duì)肉質(zhì)無(wú)影響，且制備成本低，工藝流程簡(jiǎn)便，對(duì)全球 PR 的控制和凈化發(fā)揮 了積極作用。但在應(yīng)用過(guò)程中也存在生物安全隱患，運(yùn)輸和儲(chǔ)存條 件嚴(yán)苛等問(wèn)題。

目前 Bartha-K61 株疫苗占據(jù)我國(guó)市場(chǎng)份額較大，其能使豬群 迅速產(chǎn)生高水平 gB 抗體，一定程度上遏制了 PRV 經(jīng)典毒株的傳 播[1]。

3 基因缺失疫苗

PR 基因缺失疫苗是在保留 PRV 強(qiáng)毒株免疫原性的前提下，對(duì) 其基因中的 gE、gG、gI 或 TK 等毒力相關(guān)基因或者包膜糖蛋白的 部分基因進(jìn)行切除而構(gòu)建的疫苗。當(dāng)今廣泛報(bào)道并使用的基因缺 失疫苗主要分為三種：?jiǎn)位蛉笔б呙纭㈦p基因缺失疫苗和多基因 缺失疫苗[1]。

3.1 單基因缺失疫苗

單基因缺失疫苗是缺失單個(gè)基因形成的疫苗。21 世紀(jì)之前，我 國(guó)有學(xué)者已經(jīng)利用 PRV 分離出的 Ea 株，成功研制出 EaΔTK 疫 苗，并通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)，證明其對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效果較好。然而，僅缺失 不能自主產(chǎn)生相應(yīng)抗體的 TK 基因，是無(wú)法區(qū)分野毒感染與疫苗免 疫豬群的。2015 年，Wang T 等[2]以 PRV 變異株 HN1201 為母本，構(gòu)建了單基因缺失的 HN1201ΔgE 株并制成疫苗，接種后豬的 gB抗體和中和抗體水平明顯升高，攻毒試驗(yàn)中無(wú)發(fā)病現(xiàn)象，證明了單 基因缺失疫苗防控 PR 的可靠性。

3.2 雙基因或多基因缺失疫苗

利用酶切、同源重組等基因工程技術(shù)敲除 2 個(gè)及以上的毒力基因，所得的基因缺失突變株不易返祖，制備的疫苗既能刺激機(jī)體產(chǎn)生抵抗多種變異毒株的免疫應(yīng)答，又可通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)區(qū)分野 毒感染豬和疫苗免疫豬。并且因其毒力與單基因缺失疫苗相比大 大減弱，傳毒和散毒的風(fēng)險(xiǎn)極低，仔豬和成年豬均可使用，所以大規(guī)模接種的安全性更高。

2012 年，梁苑燕等[3]嘗試用同源重組的方式研制出雙缺失株rPRV-gE-/TK-;2016 年，梁勛等[4]以有別于同源重組的方式，研制 出了雙基因缺失株 PRV-HNX-ΔgE-ΔTK，并通過(guò)試驗(yàn)證明該疫苗 對(duì)鼠、仔豬等具有良好的抗病毒感染效力。Dong J 等[5]于 2017 年研發(fā)的 PRV rZJ01ΔTK/gE/gI 三基因缺失疫苗對(duì)豬群的致病性低， 保護(hù)效果好。

4 新型疫苗

以保護(hù)性抗原為基礎(chǔ)，具有無(wú)潛伏感染和致病風(fēng)險(xiǎn)、免疫誘導(dǎo) 生成的抗體種類(lèi)豐富等亮點(diǎn)的新型疫苗，打破了傳統(tǒng)疫苗的技術(shù)瓶頸，逐漸成為疫苗創(chuàng)新的焦點(diǎn)。

4.1 重組亞單位疫苗

PR 重組亞基因單位疫苗是通過(guò) DNA 重組技術(shù)，將編碼 PRV保護(hù)性抗原的基因?qū)胝婧嘶蛟思?xì)胞中，使其高效表達(dá)并分泌 保護(hù)性抗原蛋白。重組亞單位疫苗具有安全穩(wěn)定，避免各類(lèi)有害反應(yīng)原的刺激，易于區(qū)分疫苗接種與自然感染后的免疫應(yīng)答等優(yōu)勢(shì)。 但其免疫原性差，研發(fā)成本高，所以市場(chǎng)化推廣受到阻礙。

葉麗林等[6]利用 PRV 制備免疫刺激復(fù)合物，并通過(guò)試驗(yàn)證明 其對(duì)兔的保護(hù)力極強(qiáng)。同時(shí)，他們將特定的囊膜蛋白植入 PRV 免 疫刺激復(fù)合物，以此將自然感染和接種疫苗的動(dòng)物相區(qū)分。

4.2 重組活載體疫苗

PRV 的動(dòng)物感染譜非常廣，基因組較大，是理想的重組病毒載 體。研究人員利用基因工程技術(shù)，插入多種病原的保護(hù)性抗原基因 制備的重組活載體疫苗，克服了重組亞單位疫苗的部分缺點(diǎn)，免疫原性更強(qiáng)。它既保留了 PR 的傳染特性，又對(duì)其它病毒、細(xì)菌等病原體起到預(yù)防免疫的作用，即誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了與之對(duì)應(yīng)的綜合性抗 體，真正實(shí)現(xiàn)“一針多防”。

Lei J L 等[7]以缺失 gE/gI/TK 的 PRV 變異株為載體，插入 CS FV 的 E2 基因，構(gòu)建了 rPRVTJ-ΔgE/gI/TK-E2 重組病毒，攻毒結(jié)果 顯示接種組的存活率較高，對(duì) CFS 和 PR 的抵抗力更強(qiáng)。

4.3 DNA 疫苗

PR DNA 疫苗是把編碼引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的 PRV 基因片段 導(dǎo)入質(zhì)粒中，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成抗原，進(jìn)而激 發(fā)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。DNA 疫苗解決了弱毒疫苗可能產(chǎn)生的毒力返強(qiáng)、對(duì)新型變異毒株失效的問(wèn)題，克服了母源抗體的影 響，研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程安全簡(jiǎn)易，市場(chǎng)前景廣闊[8]。未來(lái)需在提高免疫效力、精準(zhǔn)把控抗原基因的表達(dá)以避免與細(xì)胞染色體整合等問(wèn)題上 做進(jìn)一步探索。

5 結(jié)語(yǔ)

PR 尚無(wú)特效藥治療，且 PRV 導(dǎo)致的潛伏感染和多種宿主發(fā)病 等機(jī)制還未研究透徹，所以接種疫苗仍為防控的主要措施。相關(guān)科研院所應(yīng)加快安全可靠、低成本、免疫效果顯著的 PR 疫苗實(shí)驗(yàn)室研發(fā)、臨床試驗(yàn)和上市;政府有關(guān)部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管，嚴(yán)格落實(shí)防疫 和疫苗審批制度;養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)規(guī)范日常飼養(yǎng)管理，定期進(jìn)行抗原抗 體檢測(cè)和預(yù)防接種。相信經(jīng)過(guò)全社會(huì)的共同努力，在不遠(yuǎn)的未來(lái)， 我國(guó) PR 的防控和凈化工作定能取得根本性勝利。

參考文獻(xiàn)：

[1] 任衛(wèi)科，池晶晶，李秀麗，等. 豬偽狂犬病疫苗研究及應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，25（8）：37-41.

[2] Wang TY，Xiao Y，Yang QY，et al. Construction of a gE-deleted pseudorabies virus and its efficacy to the new-emerging variant PRV challenge in the form of killed vaccine [J]. BioMed Research International，2015，1-10.

[3] 梁苑燕，胡艷芬，張小榮，等. 應(yīng)用 Cre‐loxP 系統(tǒng)構(gòu)建偽狂犬病病毒gE/TK 雙缺失株[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43（11）：1802-1809.

[4] 梁勛. 利用 CRISPR/Cas9 和 Cre/lox 系統(tǒng)構(gòu)建偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[5] Dong J，Bai J，Sun T，et al. Comparative pathogenicity and immunogenicity oftriple and double gene-deletion pseudorabies virus vaccine candidates [J]. Research in Veterinary Science，2017，115：17-23.

[6] 葉麗林，姚文生，支海兵，等. 偽狂犬病病毒免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）的制備及其免疫效果檢測(cè)[J].中國(guó)獸藥雜志，2002，36（12）：27-29.

[7] Lei J L，Xia S L，Wang Y M，et al. Safety and immunogenicity of agE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant expressing the E2protein of classical swine fever virus in pigs [J]. Immunology Letters，2016，174：63-71.

[8] 張姍姍，冷雪，時(shí)坤，等. 豬偽狂犬病流行狀況和疫苗應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，39（7）：81-85.